Programme d'impulsion

Risques pour la santé liés à l'alimentation

(1990 - 1995)

Rapport final

Le texte qui suit présente des résultats de recherche du programme d'impulsion "Risques pour la santé - volet Alimentation", mis en oeuvre à l'initiative de l'Etat belge - Services du Premier Ministre - Services fédéraux des affaires scientifiques, techniques et culturelles (SSTC). La responsabilité scientifique est assumée par ses auteurs.

Indépendamment de la problématique relative à une alimentation équilibrée et/ou adaptée (protégeant la santé), les innovations technologiques dans le domaine de la production agro-alimentaire (e.a. procédés de transformation et de conservation) et les nouveaux produits (p.ex. oligofructoses) doivent également être examinés du point de vue de la santé publique. Ainsi, un contrôle microbiologique et épidémiologique efficace ne nécessite-t-il pas uniquement de meilleures méthodes d'identification et de caractérisation fine de microorganismes pathogènes, mais également des réponses aux récents défis lancés dans le domaine de la production et de la distribution de produits frais et de plats préparés.

Les relations entre l'alimentation, la pollution et la santé constituent un autre champ d'action. A cet égard, il faut non seulement déterminer le volume de contaminants - tels que les métaux lourds - ingérés par le biais de l'alimentation, mais également prêter plus d'attention au problème grandissant de l'allergie alimentaire.

Ces aspects constituent parmi d'autres le sujet du programme d'impulsion "Risques pour la Santé liés à l'Alimentation" géré par les Services fédéraux des affaires scientifiques, techniques et culturelles (1990-1995) dans lequel quatre domaines de recherche ont été identifiés :
- Contamination microbiologique
- Contamination chimique
- Alimentation fonctionnelle
- Consommation alimentaire

Les résultats de ce programme consituent la base rationnelle de recommandations notamment dans le domaine de la santé publique, de la production et la distribution agro-alimentaire et de la politique de R&D.

Pour de plus amples informations concernant ces projets de recherche veuillez contacter les auteurs ou les SSTC:

Services fédéraux des Affaires scientifiques, techniques et culturelles
8 rue de la Science
B-1000 Bruxelles
Tél. : (02) 238 34 11
Fax : (02) 230 59 12
E-mail: vdpu@belspo.be
http ://www.belspo.be

Le texte qui suit présente des résultats de recherche du programme d'impulsion "Risques pour la santé - volet Alimentation", mis en oeuvre à l'initiative de l'Etat belge - Services du Premier Ministre - Services fédéraux des affaires scientifiques, techniques et culturelles (SSTC). La responsabilité scientifique est assumée par ses auteurs.

Table de matière

A. Contamination microbiologique

A1. P. Tobback :
Modèles mathématiques pour l'analyse des risques (HACCP) et analyse globale de la conservation des aliments (aliments réfrigérés à durée de conservation prolongée)

A2. G. Waes :
Mise au point de méthodes d'identification rapides, spécifiques et sensibles de Listeria monocytogenes

A3. M. Devleeschouwer & P. André :
Contamination des aliments par Listeria monocytogenes : évaluation de la situation et étude d'améliorations techniques dans la fabrication

A4. A. Hughebaert & R. De Wachter :
Mise au point de méthodes d'identification et de quantification rapide de la contamination microbiologique des denrées alimentaires

B. Contamination chimique

B1. C. De Meester & B. Rollmann :
Mise au point de méthodes de dosage pour la quantification de contaminants mutagènes et cancérogènes dans l'alimentation

B2. S. Srebrnik-Friszmann :
Analyse des résidus de pesticides et de PCB présents dans les produits composant le panier de la ménagère et dans l'alimentation globale

B3. W. Dejonckheere :
Analyse des résidus de pesticides et de PCB présents dans les produits composant le panier de la ménagère et dans l'alimentation globale

B4. J. Staessen :
Santé publique et exposition au cadmium dans l'environnement

C. Alimentation fonctionnelle

C1. M. Roberfroid :
Développement d'une méthode nouvelle applicable à l'évaluation de la sécurité d'oligosaccharides non digestibles d'intérêt alimentaire

C2. G. Dandrifosse :
Allergies et intolérances alimentaires : effet préventif des polyamines (spermine et spermidine) ingérées

D. Consommation alimentaire

D1. H. Deelstra, D.L. Massart & C. Van Peteghem :
Programme de contrôle de l'alimentation

D2. R. Van Havere :
Belgian Extension on Nutrition Education and Data Input, Control, Training, Exchange (BENEDICTE)

A. Contamination microbiologique

A1. Modèles mathématiques pour l'analyse des risques (HACCP) et analyse globale de la conservation des aliments (aliments réfrigérés à durée de conservation prolongée)

Prof. P. Tobback, KUL - Fac. Landbouw, Afdeling Levensmiddelen en Microbiële Technologie
Kardinaal Mercierlaan 92, 3001 Heverlee

Cette étude a examiné la possibilité d'évaluer, à l'aide de modèles mathématiques, l'évolution de la qualité microbienne et visuelle d'endives ayant subi un traitement de conservation minimal, tout au long de leur cycle de vie. Cette expérience a été réalisée sur la base d'une étude de cas. L'étude a abordé les points suivants : (I) mesure de la distribution du temps de passage et des températures tout au long de la chaîne du froid, du producteur au consommateur, (ii) cinétique de l'évolution microbienne, (iii) cinétique de l'évolution de la qualité visuelle, et (iv) analyse, par simulation, des pratiques de distribution existantes.

Le temps et les conditions thermiques dans la chaîne du froid belge des légumes ayant subi un traitement de conservation minimal ont été analysés. Des températures inadaptées ont été observées lors du transport vers les supermarchés et lors du déchargement, dans les entrepôts et dans les comptoirs frigorifiques et enfin, dans les réfrigérateurs domestiques. Le temps de passage et la distribution du temps de passage dans la chaîne du froid de trois catégories de légumes ayant subi un traitement de conservation minimal ont été analysés dans trois supermarchés locaux, à l'aide d'une technique stimulus-réaction.

Cette technique a été proposée pour déterminer le temps de passage moyen et l'écart type. Plus de 50% des emballages ont été vendus lors de la première journée de commercialisation.

La cinétique du développement microbien a tout d'abord été abordée en mesurant et en modélisant l'évolution des organismes indicateurs. L'accent a été mis sur le choix du modèle, l'évaluation des paramètres et la validation du modèle. Le développement du Pseudomonas marginalis et du Lactrobacillus plantarum a été modélisée comme une fonction du temps, de la température et de la composition gazeuse (CO2). Dans des conditions thermiques dynamiques, il a été possible de prévoir le développement microbien. Dans ce cas, l'analyse s'est appuyée sur les paramètres du modèle obtenus dans des conditions constantes. Contrairement à la courbe sigmoïde des organismes indicateurs dans un milieu liquide synthétique, l'évolution de la microflore intrinsèque des endives coupées (pseudomonas, psychrotrophe, population gram-négative et le nombre de germes mésophiles aérobes) a été décrite à l'aide du modèle modifié utilisé pour le développement ralenti. Ce modèle a été dérivé en fonction du temps pour prévoir le développement en conditions dynamiques. La prévision du développement microbien en conditions thermiques dynamiques s'est cependant révélé plus difficile. Après un deuxième saut de température, la quantité de pseudomonas et de germes mésophiles a été sous-estimée.

D'autres facteurs, en dehors de la température, contrôlant le développement, l'hypothèse d'un lien entre ces phénomènes et la dégradation complète du tissu végétal (ex. libération supplémentaire de nutriments et modification de la matrice) a été avancée.

La dégradation de la qualité visuelle des endives coupées a été mesurée sur la base d'une analyse quantitative descriptive. Une analyse statistique détaillée a démontré qu'une régression linéaire pondérée des carrés inférieurs sur les données normalisées par transformation logarithmique était la meilleure méthode pour procéder à la modélisation des réponses fournies par le panel. Il a été constaté que la température était le principal facteur de contrôle de la vitesse. Contrairement au développement microbien, la vitesse de dégradation de la qualité visuelle est largement influencée par les denrées utilisées (blanchiment). La conservation visuelle des endives coupées a été évaluée par un panel de consommateurs indépendants. Alors que c'est la tolérance maximale en micro-organismes qui détermine incontestablement le contrôle de la prolifération microbiologique, la limite de la conservation visuelle dépend d'une proportion du panel de consommateurs qui déclare l'échantillon proposé impropre à la consommation.

La courbe de rejet a été décrite par une fonction logistique. La conservation visuelle a ainsi pu être rattachée à une certaine diminution de la réaction moyenne du panel quantitatif. La prévision de l'altération qualitative dans des conditions thermiques variables, à l'aide des paramètres du modèle obtenus à température constante, n'a pas donné d'excellents résultats. Les différences entre les réponses moyennes prévues et notées du panel procédant à l'analyse quantitative descriptive ont été imputées à une mauvaise évaluation des paramètres du modèle. Les prévisions en matière de conservation visuelle formulées par le panel de consommateurs dans des conditions thermiques dynamiques ont été légèrement meilleures.

Une simulation de l'effet du temps et des conditions thermiques dans la chaîne du froid sur l'évolution de la qualité microbiologique et visuelle a été réalisée sur la base des modèles et des paramètres décrits précédemment. L'atmosphère modifiée a été approchée par une atmosphère contrôlée et l'effet synergique de la composition gazeuse à basse température n'a pas été pris en compte. Il a été constaté que le contrôle de la prolifération microbiologique et la conservation visuelle des endives coupées conservées sous air n'étaient pas obtenus dans les conditions moyennes de temps et de température dans la chaîne du froid belge. Dans l'hypothèse d'une association de températures de conservation maximales et de temps de passage maximum à chaque échelon de la chaîne du froid, la conservation microbienne et visuelle est dépassée avant la consommation du produit. La réduction de la charge en micro-organismes initiale et un contrôle de la composition gazeuse à 19% CO2 (avec 2% CO2) ont permis de prolonger la conservation microbienne.

Ces observations confirment la conclusion générale en vertu de laquelle le contrôle de la température et de la durée de séjour est indispensable pour préserver la qualité de ces légumes ayant subi un traitement de conservation minimal.

Si des températures inadéquates ont été utilisées, une étiquette portant la mention "à consommer avant le ..." sur les aliments réfrigérés est inutile et ne procure qu'un apparent sentiment de sécurité et de qualité. Des Intégrateurs Temps Température sont proposés, afin de suivre l'évolution du produit alimentaire et d'indiquer l'état réel de l'attribut qualitatif ou de sécurité désiré. Les légumes ayant subi un traitement de conservation minimal requièrent d'autres facteurs intrinsèques et extrinsèques pour le contrôle de l'évolution microbiologique, afin de pouvoir reproduire précisément le développement de la putréfaction. Il a été décidé de poursuivre les recherches sur la cinétique du développement microbiologique, afin de pouvoir déterminer et sélectionner l'Intégrateur de l'Historique du Produit approprié. L'évolution de la qualité visuelle pourrait constituer une alternative valable en tant qu'Intégrateur de l'Historique du Produit intrinsèque.

De plus, lors du passage à la consommation, d'autres critères qualitatifs du produit alimentaire, tel que l'arôme doivent également être évalués. La qualité visuelle n'est dès lors pas le critère exclusif de sélection.

A. Contamination microbiologique

A2. Mise au point de méthodes d'identification rapides, spécifiques et sensibles de Listeria monocytogenes

Dr. G. Waes, Rijkszuivelstation, Brusselsesteenweg 370, 9230 Melle

Le test bactériologique classique pour la détection des Listeria monocytogenes dans les produits laitiers comporte un enrichissement en milieu liquide (2 jours), une culture sur un support sélectif (2 jours), suivis d'une série de tests de confirmation s'étalant au total sur une période de 8 à 10 jours.

Le temps de confirmation de l'identité des espèces et des gènes peut être abrégé en recourant à l'identification ADN.

Un test ADN commercial (GenProbe, San Diego, CA) a été évalué pour l'identification de colonies de L. monocytogenes cultivées sur gélose. Tous les résultats obtenus par le test ADN ont été confirmés par les méthodes d'identification biochimiques et morphologiques traditionnelles. Grâce à cette méthode très élégante et non radioactive, les L. monocytogenes sont identifiés en une demi-journée. L'ensemble du test dure 4,5 jours. Les 4 jours demeurent indispensables pour l'enrichissement bactérien. Une méthode PCR multiplex a été mise au point pour l'identification simultanée des genres (Listeria spp.) et des espèces (L. monocytogenes) des colonies cultivées sur gélose. Deux "primers" spécifiques ont été dérivés de la séquence 16S rARN pour l'identification des Listeria spp. Pour l'identification des L.monocytogenes, les "primers" spécifiques sont dérivés de la séquence génétique qui codifie l'"invasion associated protein". Les deux fragments d'ADN amplifiés, respectivement 1003 bp et 593 bp, ont été séparés par élecrophorèse sur gel d'agarose. Les résultats obtenus par la méthode PCR multiplex correspondaient à ceux obtenus par la méthode bactériologique classique. Cette concordance a été observée pour 64 échantillons de produits laitiers, soupçonnés d'être positifs, sur la base du repiquage sélectif.

La PCR permet d'abréger la procédure d'identification, ainsi que la période d'enrichissement.

Partant d'une culture pure, il est possible de détecter jusqu'à 10 bactéries L.monocytogenes par ml. Une contamination artificielle après incubation d'enrichissement a été effectuée pour tester la sensibilité de la PCR en matière de détection des L.monocytogenes dans les échantillons de fromage. La PCR a été inhibée par des composants du fromage et non pas par des composants de l'instrument d'enrichissement. La limite de détection a oscillé entre 10 et 106 ufc par ml, selon que l'analyse porte sur des fromages à pâte molle ou semi-dure.

La PCR ne peut dès lors être utilisée que pour raccourcir la procédure d'enrichissement, lorsque l'échantillon a été correctement préparé. Les L. monocytogenes peuvent même être directement détectés dans le produit alimentaire, par PCR, sans culture bactérienne. Une technique de détection des Listeria monocytogenes dans 25 ml de lait cru a été mise au point. La limite de détection a été estimée entre 5 et 10 ufc dans 25 ml de lait cru. La méthode de détection s'appuie sur une extraction chimique des composantes du lait et une amplification PCR en deux étapes, à l'aide de deux couples de "primers" dont le second est localisé au niveau interne, par rapport au premier. Cette méthode fournit des résultats en 1 jour.

Lors de l'application d'une méthode de détection directe, il est permis de s'interroger sur la capacité de la PCR à détecter les bactéries L. monocytogenes détruites. Les L. monocytogenes détruites ont été détectées par PCR, après traitement avec plusieurs désinfectants et à des températures différentes. La sensibilité de la détection par PCR dépend énormément du traitement appliqué. La dilution de cellules de L. monocytogenes dans de l'éthanol pur pendant 30 jours ne réduit la sensibilité de la PCR que de 100 fois par rapport aux cellules non traitées. Un traitement à l'aide d' 1% d'HCl et une stérilisation (124°C pendant 15 min.) empêchent toute détection par PCR après 1 heure.

Pour permettre la détection des cellules de L. monocytogenes mortes par PCR, il a été opté, pour le contrôle, en faveur d'un enrichissement d'une nuit, suivi d'une préparation simple de l'échantillon et d'une identification par PCR. Une durée d'identification de 24 à 48 heures, donnant des résultats fiables, est ainsi obtenue.

Les techniques de typage moléculaire permettent d'identifier une souche bactérienne jusqu'au niveau des sous-espèces. Il est ainsi possible de rechercher une source de contamination, élément important pour les études épidémiologiques et pour l'industrie.

La technique biologique de typage moléculaire "RAPD" ("Randomly Amplified Polymorphic DNA Profile") a été appliquée à 100 souches de L.monocytogenes. La technique RAPD s'appuie sur une PCR, à l'aide de primers arbitrairement choisis. Pour évaluer les possibilités de reproduction de cette technique, nous avons participé à l'analyse de l'OMS. Il ressort de cette étude que les laboratoires utilisant plusieurs thermocyclers et de faibles variations des concentrations tampons PCR obtiennent les plus faibles reproductibilités de résultats.

Le typage moléculaire des Listeria spp. et des L. monocytogenes a également pu être réalisé grâce à la PCR, basée sur des séquences répétitives d'ADN. Des familles de séquences répétitives d'ADN apparaissent dans le génome de plusieurs espèces bactériennes. Deux familles ont été utilisées, soit la séquence 35 à 40bp répétitive extragénique palindromique (REP) et la séquence 124 à 127 bp “enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence” (ERIC).

La REP-PCR a permis d'identifier des souches de manière comparable au typage sérique et au typage RAPD. Comparée au REP-PCR, la capacité discriminatoire d'ERIC-PCR était inférieure. L'avantage de cette méthode réside dans sa simplicité, associée à une meilleure reproductibilité.

Une méthode d'identification PCR spécifique a également été mise au point pour Brucella spp.. Les primers spécifiques sont des dérivés de la séquence 16S rRNA, après comparaison homologue des séquences de Brucalla abortus et Agrobacterium tumefaciens.

A. Contamination microbiologique

A3. Contamination des aliments par Listeria monocytogenes : évaluation de la situation et étude d'améliorations techniques dans la fabrication

Dr. P. Andre, IHE, Dép. de Microbiologie, Section Bactériologie, Rue J. Wytsman 14, 1050 Bruxelles

Dr. Devleeschouwer, ULB - Biocontaminants et Microbiologie et Hygiène, Inst. de Pharmacie - CP 205/2,
Boulevard du Triomphe, 1050 Bruxelles

Prof J. Dony, ULB - Unité des Biocontaminants et risques physico-chimiques du milieu
Boulevard du Triomphe, 1050 Bruxelles

Objectifs

- Evaluer le lien éventuel entre la contamination du fromage par Listeria monocytogenes et un défaut dans l'hygiène de fabrication
- Etablir une éventuelle relation entre les souches isolées dans les aliments, et plus particulièrement les fromages, et celles provenant des cas de listériose humaine.
- Isoler et identifier des souches inhibitrices de Listeria monocytogenes dans des fromages indemnes de contamination et procéder à des essais d'inhibition in vitro
- Formuler des recommandations dans le cadre de la Santé Publique

Pour atteindre ces objectifs, diverses approches ont été envisagées :

(a) Une étude de la contamination de fromages par Listeria. Cette étude porte sur 1902 échantillons et a permis de comparer trois méthodes de détection de Listeria. Les objectifs de cette partie étaient :
- évaluer la fréquence et le degré de contamination des fromages
- évaluer la relation entre la fréquence de contamination et le type de pâte
- évaluer la localisation de la contamination
- étudier la relation entre la contamination par Listeria spp et le degré de pollution fécale

L'analyse des échantillons de fromages ainsi que l'identification des souches ont été réalisées par l'ULB, l'IHE a confirmé les identifications des souches et procédé à la sérotypie.

(b) Une étude de caractérisation des souches de Listeria monocytogenes isolées en Belgique de différents aliments et de cas sporadiques de listériose humaine. Cette partie a nécessité le développement par l'IHE, d'une nouvelle méthode de typage sur base de polymorphisme des estérases. Cette étude porte sur 832 souches. Une analyse comparée par sérotypie et “esterase typing” a été effectuée sur les deux populations de souches (cliniques et alimentaires), et des indices de discrimination ont été calculés. L'étude a montré que la population de Listeria monocytogenes isolée de fromages est différente de celle isolée de cas cliniques. Ceci n'a pu être expliqué par des différences de secrétion du marqueur de virulence PI-PLC ni par des différences de pathogénicité de l'ensemble de ces souches dans un modèle murin Le système de typage “esterase typing” a en outre été appliqué pour la première fois par l'IHE pour incriminer un aliment contaminé dans un cas de listériose sporadique.

Par ailleurs, l'ULB a caractérisé 54 souches de Listeria monocytogenes, 27 souches humaines fournies par l'IHE et 27 souches isolées de fromages par une étude des polymorphismes d'hybridation avec des sondes d'ARNr 16s ou 23s sur profils de restriction réalisés avec deux endonucléases. Cette étude a été réalisée grâce à la collaboration de l'ULg.

(c) Une étude visant à rechercher des possibilités d'améliorations techniques visant à réduire ou éliminer la contamination. Des souches inhibitrices de Listeria monocytogenes ont été recherchées dans des fromages indemnes de contamination. Les différentes souches ont été identifiées et une étude plus complète portant sur les facteurs influençant la production de ces substances à action antagoniste et les caractéristiques de celles-ci a été menée sur deux souches. Des caractéristiques de ces molécules ont été comparée à celles de nisine.

Résumé des recherches effectuées à l'ULB

Notre étude se divise en trois parties. La première consiste en l'évaluation de la contamination par des Listeria monocytogenes de fromages belges et étrangers. La deuxième partie vise à adapter aux Listeria monocytogenes une technique de caractérisation des souches par ribotypage. La dernière partie du travail est consacrée à la recherche de souches bactériennes capables d'inhiber la croissance de L. monocytogenes et à la caractérisation des fractions antagonistes élaborées par ces souches.

Pour atteindre les objectifs de la première partie de l'étude, nous avons adapté et comparé trois méthodes de détection des Listeria : la méthode de recherche directe, la méthode par double enrichissement et la méthode par enrichissement à froid. La sérologie et la confirmation de l'identification des souches de L. monocytogenes ont été faites au Centre National de référence des Listeria à l'Institut d'Hygiène et d'Epidémiologie (Docteur P. ANDRE). Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons étudié les profils de restriction de souches de L. monocytogenes avec les endonucléases EcoR1 et HindIII. Sur ces profils de restriction nous avons fait un ribotypage par hybridation avec les sondes de l'ARNr 16S de Bacillus subtilis et de l'ARNr 23S de Clostridium perfringens.

Cette partie de l'expérimentation a été faite au laboratoire de Microbiologie de la faculté de Médecine.

Vétérinaire de l'Université de Liège (Professeur KAECKENBEECK et Docteur G. DAUBE). Dans la troisième partie de notre travail nous avons isolé des souches inhibitrices à partir de fromages indemnes de contamination par des Listeria sp. Nous avons ensuite étudié les propriétés antagonistes de souches dont l'inhibition n'était due, ni à la production de métabolites acides, ni à la production d'eau oxygénée.

Dans le premier volet du travail nous avons analysé, en trois périodes de temps distinctes, 1902 échantillons de fromages (1520 belges et 382 importés). Des Listeria sp. ont été isolées dans 446 échantillons (23,4%) et Listeria monocytogenes a été isolé dans 159 échantillons (8,4%). Nous avons enregistré une diminution du taux de contamination par L. monocytogenes au cours du temps. En effet cette contamination passe de 11% (période juin 1988 à septembre 1990) à 6,9% (période mars 1991, février 1992) et enfin à 6,4% (avril 1992, février 1993). Au cours de l'année 1995, 52 nouveaux échantillons de fromage ont été analysés. Ce dernier échantillonnage suggère entre autres que la contamination persiste chez un producteur. Les deux espèces de Listeria les plus fréquemment isolées sont L. innocua et L. monocytogenes. Le sérotype 1/2a de L. monocytogenes représente 77,9% des souches de cette espèce, le sérotype 4b 12,6%.

Les fromages à pâte molle sont les plus contaminés. La contamination se situe principalement dans la partie superficielle du fromage ou dans la totalité de celui-ci. Enfin, une relation significative a pu être établie entre la contamination par Listeria et la présence de coliformes fécaux. Le nombre de L. monocytogenes était variable selon les échantillons, allant de moins de 100/g à 106/g.

Pour le typage des souches de Listeria, les profils de restriction obtenus avec les deux endonucléases présentent un trop grand nombre de bandes pour être utilisés facilement. Par contre, les ribotypages, associant une restriction avec l'enzyme EcoR1 et une hybridation avec la sonde de l'ARNr 23S de C. perfringens ou une restriction avec l'enzyme HindIII et une hybridation avec la sonde de l'ARNr 16S de B. subtilis, ont donné les meilleures discriminations des souches particulièrement en association avec le sérotypage. Par rapport au sérotypage seul, cette technique nous a permis de montrer une contamination relativement homogène et persistante dans deux fromages fabriqués par le même producteur, alors qu'un troisième montrait une contamination plus hétérogène. Le ribotypage est donc une technique utile dans les études de contamination de denrées alimentaires.

Dans la troisième partie du travail, nous avons retenu, sur 1320 souches testées, 25 souches dont les propriétés inhibitrices semblaient intéressantes. Il s'agit de 22 souches d'Enterococcus faecalis, 2 souches de Lactococcus lactis et une souche de Pediococcus pentosaceus. Une souche d'E. faecalis et la souche de P. pentosaceus ont été choisies pour l'étude des propriétés de leur fraction antagoniste. Divers paramètres ont été étudiés : conditions de production de l'antagoniste, sa sensibilité aux protéases, à la chaleur et influence du pH et de la caséine sur l'activité. Ces études ont montré qu'il s'agissait de deux molécules possédant des propriétés de bactériocines. Ce sont, comme la nisine, des bactériocines bactéricides et thermostables. Elles ont, à l'opposé de la nisine, un spectre relativement étroit. La production de la fraction antagoniste par l'entérocoque est sous la dépendance d'un plasmide. Des essais de transfert de ce plasmide à des souches de bactéries lactiques n'ont toutefois pas abouti.

Nous recommandons un contrôle régulier de la contamination des aliments par Listeria monocytogenes. Dans le cas des fromages, un effort particulier devrait porter sur les fromages à pâte molle. Les fromages ne devraient plus être faits avec du lait cru mais devraient tous être faits avec du lait pasteurisé. L'amélioration de l'hygiène de fabrication passe par l'instauration du système HACCP (hazard analysis critical control point), ainsi que par l'étude de méthodes de détection rapides et normalisées, méthodes adaptées à chaque pathogène et à chaque type d'aliment.

La protection du fromage pourrait être assurée par l'utilisation de bactériocines pures introduites lors de la maturation, plus que par l'utilisation des souches antagonistes elles-mêmes. Une autre voie pourrait être l'utilisation des bactéries lactiques, souches naturelles de maturation du fromage, dans lesquelles les plasmides permettant la production des bactériocines auraient été transférés.

Résumé des recherches effectuées à l'IHE

Nous avons analysé des souches de Listeria monocytogenes isolées, en Belgique, de différents aliments et de cas sporadiques de listériose humaine. La distribution des souches selon leur sérovar était différente dans chacune de ces populations. Les souches provenant de fromages et celles provenant de cas de listériose humaine ont été étudiées plus en détail à l'aide d'une méthode de typage développée au cours de ce programme. Nous avons analysé les estérases de L. monocytogenes par électrophorese en gel d'amidon. Cinq estérases, numérotées de EST 1 à EST 5, par ordre décroissant de migration vers l'anode, ont été identifiées. EST 1, EST 3, EST 4 et EST 5 sont particulierement actives envers l'a-naphtyl propionate tandis que EST 2 hydrolyse pri ncipalem ent l'a-naphtyl acétate. Des études d' in hibition suggerent que ces cinq estérases sont des carboxylestérases (EC 3.1.1. 1), si ce n'est que EST 1 et EST 3 sont également légerement inhibées par le parahydroxymercuribenzoate. Chacune de ces estérases possede un poiymorphisme électrophorétique. Celui-ci a été utilisé pour développer une nouveile méthode de typage (esterase typing). 20 profils électrophorétiques d~estérases ont été définis au sein des populations de souches provenant de fromages et de cas sporadiques de listériose humaine. Les souches représentées par ces 20 types ne sont pas réparties uniformément dans ces deux populations. Cette divergence dans la répartition des souches n'a pas pu etre expliquée par des différences de sécrétion du marqueur de virulence phosphatidylinositol-specific phospholipase C, ni par le niveau de pathogénicité de ces souches chez des souris immunodéprimées. L'indice de discrimination du typage sur base du polymorphisme des estérases (Dl = 0,868) a été comparé à celui du sérotypage (Dl = 0,666) et à celui obtenu par la combinaison de ces deux méthodes (Dl = 0.8991).

A. Contamination microbiologique

A4. Mise au point de méthodes d'identification et de quantification rapide de la contamination microbiologique des denrées alimentaires

Prof. A. Huyghebaert, RUG, Fak. Landbouwwetenschappen, Technologie levensmiddelen, 
Coupure links 653, 9000 Gent

Prof. R. De Wachter, UIA, Dep. Biochemie, Universiteitsplein 1, 2610 Wilrijk

Au cours de ces 15 dernières années, l'industrie alimentaire a manifesté un intérêt croissant à l'égard des Campylobacter spp. De plus, le nombre d'infections observées, consécutives à une ingestion du Campylobacter par l'alimentation n'a cessé d'augmenter. Dans certains pays occidentaux, le nombre de cas de campylobactériose signalés dépasse même le nombre de cas de salmonellose et de de shigellose réunis. Les campylobacters font partie de la flore intestinale normale des mammifères, parmi lesquels les bovins, les porcins, les ovins et la volaille. Au cours de l'abattage et des transformations ultérieures, une contamination croisée peut intervenir. On estime jusqu'à 100% le nombre de poulets et d'autres produits avicoles commercialisés, contaminés par les campylobacters. Des températures de cuisson insuffisantes ou une contamination croisée peuvent infecter le consommateur ; la dose infectieuse du Campylobacter est par ailleurs très faible (environ 500 cellules).

Le contrôle d'un nombre important de poulets et de produits avicoles, issus des abattoirs, du commerce de gros et de détail a permis d'isoler des Campylobacter spp. dans plus de 30% des échantillons. La plupart appartiennent à la catégorie des C. jejuni. Les méthodes de détection classiques des Campylobacter spp. exigeant énormément de temps et de travail, deux sets de tests ADN disponibles dans le commerce pour l'identification des Campylobacter dans les produits alimentaires ont été évalués quant à leur vitesse, leur spécificité et leur sensibilité. Les deux sets ont révélé une spécificité de près de 100%, bien que pour l'obtention d'un signal positif, la présence d'au moins 107 cellules de Campylobacter par ml semble nécessaire, des chiffres qui ne peuvent être obtenus qu'après un long enrichissement. L'exécution relativement rapide (45 min. à 3h) est réduite à néant par les 2 jours d'enrichissement. Une technique permettant d'abréger la période d'enrichissement semblait nécessaire. Le choix dans ce domaine s'est porté sur le fractionnement immunomagnétique (FIM), une technique par laquelle des microorganismes de l'échantillon alimentaire sont isolés et concentrés par la liaison à des anticorps spécifiques recouvrant des particules magnétiques. L'application d'un champ magnétique permet d'isoler ces particules des autres organismes ; elles sont ensuite repiquées de manière classique ou appliquées dans des techniques de détection rapide. Ce projet a utilisé les Dynabeads© M-280, activés au tosyl et recouverts de l'anticorps anti-Campylobacter disponible dans le commerce. Les tests ont révélé qu'une bonne liaison pouvait être réalisée entre les Dynabeads et l'anticorps d'une part, et entre l'anticorps et l'antigène (Campylobacter), d'autre part.

Les cultures de Campylobacter en milieu liquide avaient pour objectif prioritaire l'optimalisation de la technique de fractionnement immunomagnétique, par l'étude des principaux paramètres du processus. Le contrôle de la sensibilité et de la spécificité du système FIM dans les cultures microbiennes a permis d'obtenir un rendement atteignant 35%, tandis que dans des conditions optimales, la limite de détection atteinte est de l'ordre de 200 cellules de Campylobacter. L'utilisation du FIM dans des cultures mixtes a permis de constater une réactivité croisée et l'apparition de liaisons aspécifiques par d'autres organismes. La technique du FIM a finalement été appliquée à 90 échantillons avicoles contaminés naturellement. Ils ont été soumis à un pré-enrichissement et à un enrichissement (total : 7h) et ensuite à un fractionnement immunomagnétique parallèlement à la méthode classique de détection du Campylobacter. Après fractionnement, les beads ont été d'une part repiqués sur une série de vecteurs d'isolation sélectifs du Campylobacter spp. et d'autre part, appliqués dans une évaluation PCR spécifique. La méthode de détection classique a identifié près de 50% d'échantillons positifs. L'association FIM-repiquage n'a donné un résultat positif que pour 12% des échantillons, tandis que la combinaison FIM-PCR donnait 63% d'échantillons positifs. L'association d'une technique de concentration spécifique (FIM) et d'une méthode d'identification particulièrement sensible et spécifique (PCR) a non seulement permis de détecter un plus grand nombre d'échantillons positifs, mais les résultats ont par ailleurs été obtenus beaucoup plus rapidement. Alors que la méthode traditionnelle de détection donne un résultat encore incertain, au plus tôt, après 72 h, la combinaison FIM-PCR apporte une réponse spécifique dans un délai de 30 h, voire de 12 h, dans des conditions idéales.

Les méthodes conventionnelles employées pour la détection et l'identification des campylobacters sont longues, nécessitent énormément de travail et sont parfois même peu fiables. La réaction en chaîne polymérase ou PCR constitue une méthode de détection alternative rapide et sensible. Une première méthode a été conçue, basée sur les séquences 16S rADN. Des primers PCR universels et des probes oligonucléotides spécifiques ont été mis au point sur la base de séquences 16S rADN déjà disponibles et d'autres que nous avons déterminées. L'amplification PCR, suivie d'une hybridisation permet une détection groupe spécifique des campylobacters entéropathogènes. La séquence 16S rADN ayant des limites en ce qui concerne le développement de détection groupe-spécifique, nous sommes passés à la séquence 23S rADN.

Une méthode, basée sur la séquence 23S rADN, a été mise au point pour la détection spécifique du Campylobacter et de l'Arcobacter. A partir d'une quarantaine de séquences d'une zone variable de la séquence 23S rADN pré-déterminées, des primers spécifiques ont été conçus pour (a) la détection groupe-spécifique de campylobacters thermophiles, (b) la détection espèce-spécifique des campylobacters thermophiles, (c) la détection espèce-spécifique des campylobacters non-thermophiles, (d) la détection groupe-spécifique des arcobacters et (e) la détection espèce-spécifique des arcobacters.

Des primers PCR spécifiques pour les campylobacters thermophiles et non-thermophiles ont permis l'identification d'isolats cliniques, que d'autres analyses n'avaient pas pu identifier avec certitude.

L'évaluation PCR pour la détection groupe-spécifique des campylobacters thermophiles a été appliquée à la détection des Campylobacter spp. dans des échantillons alimentaires enrichis. 144 échantillons de poulet ont été analysés et près de 46% ont semblé positifs sur la base de l'évaluation PCR, la méthode conventionnelle donnant quant à elle 43% de résultats positifs. Dans 34% des échantillons alimentaires environ, l'évaluation PCR et les méthodes classiques ont donné des résultats contradictoires. Des recherches complémentaires ont démontré qu'ils n'étaient pas imputables à une détection de cellules de Campylobacter mortes par l'évaluation PCR ou à un écart du seuil de détection des deux méthodes.

Une méthode de détection des produits PCR alternative, la PCR ELISA a été testée. Par rapport aux méthodes conventionnelles d'analyse des produits PCR, la PCR ELISA ne présente pas une sensibilité supérieure, mais elle permet de procéder à une détection automatisée, autorisant le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons.

B. Contamination chimique

B1. Mise au point de méthodes de dosage pour la quantification de contaminants mutagènes et cancérogènes dans l'alimentation

Dr. C. De meester & Dr. Rollmann, UCL - Fac. de Médecine, Unité de Mutagénèse et de Teratogénèse,
Av. E. Mounier 72, 1200 Bruxelles

Une famille de contaminants alimentaires appartenant à la classe chimique des amines aromatiques hétérocycliques (HAAs) est produite durant le traitement par la chaleur d'aliments riches en protéines. Ces composés possèdent des propriétés génotoxiques très marquées ; certains comptent parmi les plus puissants mutagènes connus et se sont révélé cancérogènes pour les rongeurs et le singe. Différentes informations épidémiologiques semblent indiquer que ces substances pourraient être impliquées comme agents étiologiques du cancer colorectal et peut-être aussi d' autres formes de tumeurs.

Pour ces différentes raisons, des méthodes de quantification précises sont nécessaires pour pouvoir évaluer le risque pour l'homme de consommer des aliments contaminés par ces substances. Ce problême reste un défi parce que les HAAs se retrouvent généralement à des niveaux très bas (ng/g) dans les matrices alimentaires chauffées comme les produits de viande ou de poisson cuits.

Pour ces raisons, des méthodes d'extraction complexes doivent être appliquées, avant l'analyse. Dans le passé, différentes procédures d'extraction par solvant ont été proposées, comprenant des schémas complexes avec des taux de récupération décevants. Il est actuellement reconnu que la méthode mise au point par G.A. Gross (1990) est la plus fiable, avec pour avantage principal un schéma de travail en continu qui évite les pertes durant les transferts, bien que le taux de récupération de certains composés comme le PhlP demeure insuffisant. Cette méthode d'extraction, basée sur l'extraction en phase solide, en tandem, avec analyse par HPLC est suffisamment simple que pour être largement recommandée comme méthode de routine. Elle comprend une phase de nettoyage de l'échantillon par une succession de plusieurs étapes de purification faisant usage de colonnes de terre à diatomée, échange cationique et phase inversée. L'addition de différents standards est nécessaire du fait de la différence d'efficacité d'extraction des différents HAAs, avec le TriMelQx comme standard interne. La quantification est réalisée par HPLC avec une colonne à phase inversée et détection en UV ou par électrochimie (EC).

Le but de nos recherches qui ont commencé en 1991, était de développer la détection EC afin d' améliorer non seulement la sensibilité mais aussi la spécificité des analyses.

Pour ces différentes raisons, il s'est avéré nécessaire d'analyser avec soin différents paramètres analytiques qui peuvent influencer la détection EC, après séparation par HPLC.

Les paramètres suivants ont été étudiés :
- pKa des HAAs
- pH du solvant
- composition du tampon
- effet des agents de pairage d'ions - force ionique
- utilisation d'une phase mobile ternaire au lieu d'une phase binaire - choix du standard interne
- choix de la colonne
- choix du potentiel d'électrode

Un intérêt particulier a été consacré aux sensibilités comparatives de la détection UV par rapport à la détection EC. Dans l'état actuel du projet nous avons obtenu un gain de sensibilité de l'ordre de 5 pour la détection EC. D' un point de vue plus fondamental, le mécanisme de l'oxydation électrochimique a également été étudié afin d'expliquer les réactions d'oxydation qui se déroulent au niveau de l'électrode.

D'autre part, des paramètres qui peuvent influencer la séparation chromatographique ont également été étudiés : I'efficacité de la colonne a phase inversée a été comparée avec la phase stationnaire échangeuse de cations. Ces résultats ont été comparés avec ceux obtenus en électrophorese capillaire, qui a été proposé comme méthode alternative.

Finalement, la méthode proposée par G.A. Gross a été appliquée à différentes matrices alimentaires afin de valider la procédure qui pourrait être recommandée comme méthode de routine. Les limites de détection de 4 HAAs : IQ, MelQ, MelQx et 4,8-DiMelQx sont très similaires avec des valeurs aux alentours de 5 p moles, avec notre système de détection UV. La séparation des composés est satisfaisante, avec des taux de récupérations compris entre 70 et 80%, avec une procédure d'extraction complête d'un mélange de composés purs. Différents produits de viande chauffés ont été analysés : I'extrait de viande commercial, de la saucisse grillée et du boeuf haché grillé. Il ressort de ces essais que les taux de récupération des HAAs recherchés sont assez différents

La détection UV a été comparée à la détection EC après séparation par HPLC avec un solvant isocratique, sur 3 produits de viande chauffés :

- Dans de l'extrait de viande du commerce, les quantités suivantes de MelQx, IQ et MelQ ont été retrouvées, soit respectivement : 27,7 - 17,6 et 2,9 ng/g.

- Dans de la viande de boeuf hachée, cuite pendant des temps variables, les quantités de MelQx, IQ et MelQ retrouvées après détection UV, se situaient respectivement à : 2,16-2,49 / 13,1-27,3 / 1,72-2,5 ng/g. La détection EC a donné des résultats tres similaires.

- Dans un mélange commercial de viande grillée ("pitta") les composés MelQx, IQ et MelQ ont été retrouvés a des concentrations respectivement de : 1,97 - 16,4 et 2,2 ng/g (détection UV) ou : 2,5 - 18,5 et 2,7 ng/g (détection électrochimique).

Ces résultats démontrent que la détection simultanée par UV et par EC produit des chiffres très similaires. La dispersion des résultats révéle cependant que la reproductibilité de la méthode peut etre améliorée, plus particulierement pour l'IQ qui n'est pas très bien séparé. Dans l'état actuel de ces recherches, nous pouvons conclure que la détection EC est fiable, comparée à la méthode UV plus classique, bien que des différences subsistent suivant la nature de l'échantillon analysé.

La méthode originale de séparation par HPLC sur colonne échangeuse de cations (IEC) qui a été développée présente différents avantages par rapport à la méthode de séparation classique sur phase réverse :
- bonne séparation des HAAs les plus importantes : IQ, MelQ, MelQx, 4,8uiMelQx et PhlP
- solvant facile à préparer (élution isocratique)
- réduction importante du temps d'analyse
- réduction de l'étalement des pics séparés
- réduction du prix de la colonne nécessaire
- simplification de la pompe HPLC nécessaire.

D'autre part, les méthodes IEC/EC et IEC/UV ont été validées au cours d'un exercice interlaboratoire portant sur une solution méthanolique de composition inconnue.

Il a été démontré que ces deux méthodes sont utilisables pour l'analyse en routine d'aliments chauffés comme l'extrait de viande commercial ou de la viande de boeuf grillée.

B. Contamination chimique

B2. Analyse des résidus de pesticides et de PCB présents dans les produits composant le panier de la ménagère et dans l'alimentation globale

Dr. S. Srebrnik-Friszman, IHE, Serv. Denrées Alimentaires, Rue J. Wytsman 14, 1050 Bruxelles

Durant ces dernières décades de grandes quantités de pesticides ont été utilisées en agriculture et en horticulture. De plus l'industrie a utilisé des quantités importantes de composés chlorés dont, les polychlorobiphényls.

Cet usage intensif a eu un impact significatif sur l'environnement et par conséquence sur les éléments de la chaîne alimentaire.

Suite à de nombreuses études, la toxicité de ces produits a été mise en évidence. Cette toxicité a amené les états à limiter, contrôler, voire interdire l'usage de ces produits.

Malgré ces dernières actions, la stabilité de ces produits est telle que l'on continue à les détecter dans l'environnement. Néanmoins les concentrations ont diminué graduellement jusqu'au niveau actuel proche de la limite de détection.

La présente étude vise à relever les concentrations en pesticides organochlorés et en polychlorobiphényls dans les différents produits courants consommés, et à vérifier si ces concentrations peuvent avoir des effets néfastes pour la santé de la population.

Pour réaliser cet objectif, 2399 échantillons de nature diverse, représentatifs de la consommation des ménages ont été analysés. Il s'agit d'échantillons de viande (porcs, boeufs, moutons, veaux, chevaux, poulets, lapins, charcuteries), de poissons (de mer et d'eau douce), de lait (laits et produits laitiers), d'huiles végétales (huiles et margarines) et d'oeufs.

Il est apparu lors de ces analyses, que les concentrations en pesticides sont faibles. Nous n'avons pas pu mettre en évidence de différences significatives entre les concentrations déterminées sur base de la denrée fraîche, et les concentrations déterminées sur base de la denrée ayant subit un traitement culinaire. C'est donc sur la seule base des échantillons non traités que sont présentés ici les résultats.

Chaque résultat a été comparé aux normes Belges en vigueur lors de l'étude (Arrêté Royal du 23 octobre 1991 basé sur les directives Européennes, Annexes B et tableau 3.B.). Il est à noter que les polychlorobiphényls ne sont pas repris dans les teneurs maximales autorisées. Les poissons ne sont pas repris dans cet Arrêté. Au vu des résultats obtenus dans cette étude, nous pouvons conclure que les concentrations en pesticides organochlorés répondent aux normes de la législation en vigueur.

Afin d'examiner d'éventuels effets néfastes sur la santé, les valeurs moyennes, médianes et maximales des concentrations ont étés comparées aux doses journalières admissibles (D.J.A. ou Acceptable Daily Intakes A.D.I.) disponibles. La D.J.A. est la quantité de contaminant pouvant être ingérée quotidiennement durant toute la vie sans causer d'effets néfastes sur la santé.

Le tableau ci-après donne un aperçu du pourcentage de la D.J.A., pour une concentration moyenne en résidus de pesticides ingérés, pour une consommation moyenne de denrée, par une personne de 60kg.

Pour la consommation de toutes les denrées			
Contaminants	D.J.A. (mg/kg/jour)	Pourcentage de la D.J.A.	
a-HCH
b-HCH
Lindane
Hexachlorobenzène
Heptachlorépoxide
Dieldrin
DDT
Polychlorobiphényl	8
8
8
6
0.1
0.1
20
5	0.070
0.110
0.158
0.167
6.354
11.591
0.134
3.000	

Les valeurs de pourcentage de la D.J.A. montrent que les recommandations de l'organisation mondiale de la santé (WHO) et l'organisation mondiale de l'agriculture et de l'alimentation (FAO) sont respectées. Les valeurs les plus élevées de la table sont dues a des recommandations plus strictes des organismes pour ces types de substances.

En conclusion, à part quelques cas isolés, les normes en vigueur pour les pesticides organochlorés sont respectées. Le pourcentage de D.J.A. correspondant aux concentrations moyennes de résidus, et pour une consommation journalière moyenne simultanée de toutes les denrées, sont inférieures à 11,6 pourcent des valeurs tolérées par les organismes internationaux.

Dans le cas des polychlorobiphényls aucune norme de tolérance n'est spécifiée en Belgique. On remarque, au vu des résultats d'analyses que toutes les concentrations moyennes sont inférieures à 16.9 mg/kg de denrées, avec des valeurs plus élevées pour les poissons et les produits laitiers que pour d'autres denrées.

Afin de confirmer les valeurs obtenues et observer des variations éventuelles des concentrations de pesticides organochlorés ou de polychlorobiphényls il convient de maintenir un programme de surveillance des denrées alimentaires. En particulier les produits laitiers et les poissons devraient être surveillés en priorité pour leur teneur en polychlorobiphényls.

B. Contamination chimique

B3. Analyse des résidus de pesticides et de PCB présents dans les produits composant le panier de la ménagère et dans l'alimentation globale

Prof. W. Dejonckheere, RUG - Fac. Landbouw, Lab. Fytopharmacie, Coupure Links 653, 9000 Gent

L'utilisation des pesticides en agriculture et en horticulture est officiellement autorisée par les Ministères de l'Agriculture et de la Santé publique. Les prescriptions en la matière permettent une application efficace des pesticides et la présence d'une quantité de résidus acceptable d'un point de vue toxicologique, lors de la récolte des produits comestibles.

En vertu du principe d'une bonne pratique agricole, les pesticides sont uniquement autorisés pour lutter efficacement contre les maladies et les épidémies et à condition que les normes de tolérance des résidus, basées sur des données toxicologiques, ne soient pas dépassées.

Cette étude a voulu vérifier, dans une première étape, si les aliments d'origine végétale et leurs éventuels dérivés respectaient les normes de tolérance légales en matière de résidus, en d'autres termes, si les résidus n'étaient pas trop nombreux lors de l'achat de ces produits alimentaires. Sur une période de deux ans, du 1er avril 1991 jusqu'au 31 mars 1993, 3.698 échantillons de 21 variétés différentes de légumes, 15 variétés de fruits et 7 variétés de produits divers ont ainsi été prélevés.

Ces échantillons ont été soumis à de multiples types d'analyses, notamment les multi-méthodes qui révèlent la présence de plusieurs pesticides en une seule analyse, mais aussi des méthodes spécifiques, grâce auxquelles une variété déterminée de pesticide peut être détectée. L'ensemble de l'étude a pu s'appuyer sur 12 méthodes d'ananlyse et près de 130 pesticides ou métabolites ont pu être identifiés. Grâce à des informations relatives à l'utilisation des pesticides et aux résidus observés, les méthodes d'analyse permettant la détection des pesticides normalement utilisés pour toute culture et donnant des résidus ont pu être appliquées.

Le pourcentage de dépassement des normes tolérées en matière de résidus établi lors des analyses est le suivant :

	% d'échantillons non conformes aux normes légales	% d'échantillons présentant des résidus pour lesquels il n'existe aucune norme	Total d'échantillons non conformes	
Légumes
Fruits
Divers	6,9
0,7
1,2	2,5
1,4
0	9,4
2,1
1,2	
Total	4,2	1,8	6,0	

Les échantillons non conformes aux normes légales se situent principalement dans la catégorie des légumes verts dont la plante entière est récoltée, avec dès lors les éventuels résidus de l'ensemble des pesticides utilisés. Le risque de dépassement du seuil de tolérance est évidemment plus important que pour les tomates ou les pommes où la plupart des pesticides sont appliqués pour maintenir la plante en bonne santé, le produit finalement récolté, présentant proportionnellement moins de pesticides et par conséquent, moins de résidus.

Les échantillons présentant des résidus pour lesquels il n'existe aucune norme sont le résultat de l'utilisation de produits non autorisés, et n'ayant dès lors pas de norme de tolérance (ces produits peuvent éventuellement être autorisés dans des pays voisins) ou sont imputables à la présence de résidus sur des produits cultivés en dehors de la Belgique (raisin, orange, banane) et pour lesquels le pays producteur autorise l'utilisation de ces pesticides, mais pour lesquels la liste des normes belge ne prévoit pas de résidus tolérés.

Cette étude a voulu ensuite examiner la quantité de pesticides ingérée par le biais de l'alimentation. Les aliments pour lesquels la première analyse avait révélé la présence de résidus ont été traités conformément à la préparation précédant la consommation (lavage, épluchage, cuisson, etc). Une nouvelle analyse a ensuite été effectuée et un deuxième ou troisième traitement culinaire, suivi d'une nouvelle analyse a parfois été réalisé.

Cette étude a permis de déterminer la diminution de la teneur en résidus lors des préparations culinaires normales, information évidemment importante pour le consommateur, afin de lui permettre de limiter l'ingestion de pesticides via l'alimentation.

Pour déterminer la quantité de pesticides ingérés, la quantité de résidus observée dans l'aliment prêt à la consommation a, à chaque fois, été calculée pour 100 g de produit et exprimée en un pourcentage de la valeur ADI. Il s'agit de la valeur toxicologique quotidienne admise pour un individu de 60 kg, établie par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et l'organisation Internationale de l'Alimentation et de l'Agriculture (FAO).

Afin de pouvoir déterminer l'ingestion moyenne de pesticides sur la base des aliments analysés, il faut connaître la consommation quotidienne moyenne de ces produits par personne. La Belgique ne disposant d'aucune statistique officielle dans ce domaine, une évaluation a été effectuée en s'appuyant sur des informations relatives au comportement d'achat en Belgique, émanant de l'Institut National des Statistiques (INS) et du Landbouw Economisch Instituut (L.E.I.).

Nous avons ensuite sélectionné les préparations culinaires les plus courantes telles que le lavage pour la salade, l'épluchage pour les carottes, mais également l'absence de traitement comme pour la pomme ; le pourcentage ADI ingéré quotidiennement par la consommation moyenne de chacun des aliments a été calculé pour chacun des pesticides observés.

Enfin, pour chaque pesticide, le pourcentage total d'ADI a été calculé pour l'ensemble des aliments analysés.

D'une manière générale, dans l'hypothèse moyenne, avec une consommation quotidienne des aliments étudiés :
- 54 pesticides au total sont ingérés
- le pourcentage ADI est supérieur à 1% pour deux pesticides seulement, à savoir les dithiocarbamates (1,9%) et le bromide (1,6%).

En additionnant l'ensemble des pourcentages ADI, ce qui n'est pas admissible d'un point de vue scientifique, l'ingestion totale ne représente que 10,7% de l'ingestion admise.

Cette étude permet de dégager les conclusions générales suivantes :
- les normes de tolérance sont régulièrement dépassées, principalement pour les légumes et surtout les légumes verts
- le traitement des fruits et des légumes avant leur consommation (lavage, épluchage, cuisson) permet de réduire sensiblement la quantité de résidus ingérés
- l'ingestion réelle de pesticides par le biais de l'alimentation est nettement inférieure aux normes jugées acceptables d'un point de vue toxicologique.

Deux remarques s'imposent :

1. Une enquête similaire effectuée dans d'autres pays pourrait donner des pourcentages de dépassement des normes de résidus inférieurs à la Belgique. Il convient de préciser que les résultats d'étude des résidus sont largement déterminés par le nombre de méthodes d'analyse différentes utilisées. Dans la plupart des cas, à l'inverse de la présente étude, seules les multi-méthodes sont appliquées, les méthodes spécifiques le sont plus rarement (ex. chloropropham de profame pour les pommes de terre, bromide pour les légumes verts).

2. La limitation des ressources financières, des instruments et des méthodes d'analyse disponibles n'a pas permis une étude exhaustive des aliments et il est dès lors impossible d'affirmer que tous les pesticides éventuellement présents ont été identifiés.

L'ensemble des résultats détaillés de cette étude figure dans 4 annexes, disponibles sur disquette.

Les titres des différentes annexes sont :
1. Résultats calculés pour 100 g de chaque aliment
2. Résultats calculés pour une consommation quotidienne moyenne de chacun des aliments
3. Résultats calculés pour 100 g d'aliment et pour chaque pesticide
4. Résultats calculés sur la consommation quotidienne moyenne et pour chaque pesticide.

B. Contamination chimique

B4. Santé publique et exposition au cadmium dans l'environnement

Prof. J. Staessen, KUL, UZ Gasthuisberg, Klinisch Lab. Hypertensie, Inwendige Geneeskunde-Cardio,
Herestraat 49, 3000 Leuven

Contexte : L'étude PheeCad est une étude de population longitudinale qui analyse les effets sur la santé de l'exposition au cadmium et au plomb. Les participants ont été tirés au sort parmi la population de deux zones, choisies pour pouvoir étudier un vaste champ d'exposition au cadmium.

Transmission du cadmium : L'absorption de cadmium a été étudiée auprès de 230 personnes (âgées de 20 à 83 ans), consommant des légumes cultivés dans leur jardin, sur un sol acide (pH moyen +/- 6.3) sablonneux. L'étude a porté sur la corrélation entre la teneur en cadmium du sang et des urines et la concentration de cadmium dans le sol (varaient entre 0.2 et 44 ppm). Septante-six personnes appartenaient à la catégorie des fumeurs et 122 habitaient dans une zone où la pollution par le cadmium était avérée. L'élimination urinaire du cadmium représentait en moyenne, chez l'ensemble des 230 participants, 8.7 nmol/24h (extrêmes 1.3-47 nmol/24h) et une corrélation positive a pu être établie avec la concentration de cadmium dans le sol. Après correction, en fonction de l'âge, un doublement de la concentration de cadmium dans le sol s'accompagnait chez les hommes d'une augmentation de 7% (r2 = 0.05 ; p = .04) de l'élimination urinaire et de 4% (r2 = 0.02 ; p = .05) chez les femmes.

Il est permis d'en conclure que chez une population rurale, consommant des légumes cultivés sur un sol pollué, de nature légèrement acide et sablonneux, une élimination urinaire de cadmium de 2 à 4% peut s'expliquer par la teneur en cadmium du sol.

Dysfonctionnements rénaux et exposition au cadmium : L'étude PheeCad a voulu vérifier si, dans 10 régions polluées au cadmium à des degrés divers, un lien pouvait être démontré entre les dysfonctionnements rénaux glomérulaires et tubulaires d'une part, et l'exposition interne (mesurée dans les urines) et externe (mesurée dans l'environnement) au cadmium. Le cadmium a été dosé dans le sol et dans des échantillons de légumes dans 10 régions, dont 6 étaient limitrophes de fonderies non-ferreuses. La fonction rénale et les concentrations de métaux dans le sang et dans les urines ont été mesurées chez 703 personnes désignées par le hasard (participation : 78%). Comparées aux quatre autres régions, les six régions polluées présentaient de plus fortes concentrations de cadmium dans le sol (4.86 vs. 0.81 ppm), ainsi que dans les légumes cultivés sur place, tels que le céleri (2.43 vs. 0.68 ppm) et les haricots (0.42 vs. 0.15 ppm). Les habitants des régions polluées éliminaient davantage de cadmium (10.5 vs. 7.9 nmol/24h) et de cuivre (0.16 vs. 0.14 mmol/24h) par les urines, présentaient une plus forte concentration sérique de créatinine (100 vs. 97mmol/l), une élimination urinaire supérieure de microglobuline b2 (109 vs. 95 mg/24h) de retinol-binding-protein (136 vs. 118µg/24h) et d'aminoglucosides b acétyle-N (1.78 vs.1.38U/24h).

La classification à la créatinine était inférieure dans les six régions polluées (87 vs. 92/ml/min). Dans les diverses régions, une corrélation positive a pu être établie entre la concentration de cadmium dans le sol et la teneur en cadmium du céleri (r=0.77), des haricots (r=0.67) et des urines des habitants (r = 0.76). La corrélation est apparue négative entre la classification à la créatinine et la concentration de cadmium dans le sol (r =0.78), dans le céleri (r =0.90) et dans les haricots (r =0.70). Les corrélations entre les concentrations de cadmium et l'élimination urinaire sur 24 heures de microprotéines et d'aminoglucosides b acétyle-N étaient positives, mais étaient inférieures à celles observées pour la classification à la créatinine.

En conclusion, les précédentes émissions des fonderies non-ferreuses ont continué à polluer l'environnement par le cadmium et cette pollution a été transmise à la chaîne alimentaire. Cette pollution expose l'ensemble de la population à un risque supérieur d'insuffisance rénale et de modifications de la gestion du zinc et du cuivre par l'organisme.

Exposition à l'arsenic anorganique : L'exposition de la population à l'arsenic anorganique, agent carcinogène bien connu, a été contrôlée en Belgique en dosant l'arsenic dans des échantillons d'urine de 24 heures, rassemblés dans le cadre des études de population CadmiBel (1985-1989) et PheeCad (1991-1995). La première étude s'est déroulé dans des zones urbaines industrialisées (Liège : n= 664, Charleroi : n= 291), dans une zone rurale dont la population aurait pu être exposée par l'intermédiaire des émissions des fonderies non-ferreuses (Campine nord-occidentale : n= 93, Campine nord-orientale : n = 244). Les résultats de CadmiBel démontrent qu'après correction en fonction du sexe, de l'âge et de l'indice d'obésité, l'élimination urinaire d'arsenic sur 24 heures était inférieure (p<.001) à Liège (91 nmol) par rapport à Charleroi (155 nmol), à Hechtel-Eksel (114 nmol) et à la Campine nord-occidentale (158 nmol) La plus forte élimination d'arsenic sur 24 heures a été notée en Campine nord orientale. Entre 1991 et 1995, les zones rurales (n=609) ont une nouvelle fois été analysées, de même qu'une zone urbaine (Louvain, n= 152). Au cours de cette période, l'élimination urinaire de l'arsenic sur 24 heures était inférieure, dans les zones rurales (Hechtel-Eksel 99 nmol ; Campine nord-occidentale et orientale 97 nmol) aux valeurs observées six années auparavant et comparables aux valeurs notées à Louvain (108 nmol). Le suivi longitudinal de 529 habitants de la zone rurale a démontré que leur élimination urinaire de l'arsenic sur 24 heures passait de (p<.001) 222 à 100 nmol.

Il est permis d'affirmer en conclusion que l'industrie est fort probablement à l'origine de l'exposition accrue en Campine nord-orientale entre 1985 et 1989 (1), puisque l'élimination urinaire de l'arsenic ne suivait pas les écarts régionaux en matière de concentrations d'arsenic dans l'eau potable, (2) puisque l'exposition accrue n'a été observée que dans des zones situées en aval, pour ce qui est de l'orientation des vents, des sites industriels, (3) puisque l'élimination urinaire d'arsenic était inversement proportionnelle à la distance séparant le domicile des habitants des fonderies de zinc, et (4) puisque la diminution de l'élimination urinaire d'arsenic pouvait s'expliquer, au fil des ans, par une réduction de l'activité industrielle.

Il est intéressant de noter que dans le nord de la Campine, entre 1985 et 1989, le réseau officiel n'a pas décelé une progression de la concentration de cet arsenic dans les poussières en suspension ou les poussières retombées. Ces observations prouvent qu'il est nécessaire de valider les méthodes de contrôle de l'environnement, par des dosage directs de l'exposition interne des populations susceptibles d'être exposées à une pollution naturelle ou industrielle.

Exposition au plomb et tension artérielle dans le cadre d'une étude longitudinale. Pour pouvoir procéder à l'évaluation du lien entre une faible exposition au plomb et la tension artérielle, un échantillon de la population belge a été analysé entre 1985 et 1989 (n=728 ; 49% d'hommes ; fourchette d'âge : 20-82 ans) ; cette étude a été renouvelée entre 1991 et 1995. Au début de l'étude et lors de son suivi, la tension artérielle a été mesurée à l'aide de méthodes conventionnelles (15 au total) et un contrôle ambulatoire, s'étalant sur une période de 24 heures a été ajouté lors du suivi. Le degré d'exposition a été estimé sur la base de la teneur en plomb et en protoporphyrine de zinc du sang. Des analyses à variables multiples ont pris en compte les covariables suivantes : sexe, âge, obésité, tabagisme, consommation de boissons alcoolisées, activités physiques, exposition sur le lieu de travail, classe sociale, ménopause, médication, hématocrite, transférase sérum-calcium et -glutamyle. Au début, la tension artérielle s'élevait en moyenne à (systolique/diastolique ± SD) 130±17/77±9 mm Hg, la teneur en plomb du sang à 0.42mmol/l (fourchette : 0.08-3.50) et à 1.0mg/g (0.3-19.5) hémoglobine pour la protoporphyrine de zinc. Après un suivi moyen de 5.2 années, la teneur en plomb (p<.001) avait baissé de 0.14 mmol/l (32%). Des modifications légères, mais statistiquement significatives (p<.01), ont été observées dans la tension artérielle systolique (- 1.5 mm Hg) et diastolique (+ 1.7 mm Hg), mesurée à l'aide de méthodes conventionnelles, ainsi que pour la protoporphyrine de zinc (+ 0.5 mg/g hémoglobine).

De plus, la mesure de la teneur en plomb du sang et de la teneur en protoporphyrine de zinc, au début de l'étude n'a pu anticiper le développement d'une hypertension chez 47 patients (risque associé au doublement de la teneur en plomb du sang : 1.2 ; Bl 0.7-2.0). Lors d'une analyse au cours de laquelle chacun des participants avait été caractérisé par l'ensemble des mesures disponibles, aucune corrélation n'a pu être établie entre la tension artérielle conventionnelle et la concentration en plomb ou en protoporphyrine de zinc dans le sang.

En outre, les tensions artérielles mesurées de manière ambulatoire sur une période de 24 heures lors du suivi (moyenne 119±11/71±8 mm Hg) ne révèlent aucun lien cohérent avec la concentration de plomb et de protoporphyrine de zinc dans le sang.

En conclusion, ces observations semblent aller à l'encontre de l'hypothèse selon laquelle l'actuelle exposition au plomb pourrait être associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaire, entraînée par un relèvement de la tension artérielle.

C. Alimentation fonctionnelle

C1. Développement d'une méthode nouvelle applicable à l'évaluation de la sécurité d'oligosaccharides non digestibles d'intérêt alimentaire

Prof. M. Roberfroid, UCL - Fac. de Médecine, Unité de Bioch. Toxicol. et Cancérologique (BCTC 7369),
Av. E. Mounier 72, 1200 Bruxelles

Le présent travail s'inscrit dans le développement de méthodologies nouvelles applicables à l'évaluation des risques pour la santé liés à la consommation de nouveaux ingrédients alimentaires, en particulier des fructooligosaccharides non digestibles. L'objectif de cette étude était, plus précisément, d'étudier l'influence de la consommation d'oligofructose sur le métabolisme lipidique, ainsi que sur la sensibilité du foie à l'action stéatogène de certains agents chimiques susceptibles d'être ingérés concomittamment.

L'administration aux rats d'une nourriture enrichie en oligofructosaccharides (OFS) (10%) induit une diminution importante (30-50%) de la concentration sérique en triglycérides-VLDL des le début du traitement. Les facteurs hépatiques susceptibles d'être à l' origine de cette hypo triglycéridémie ont été recherchés en utilisant des hépatocytes isolés à partir de rats recevant, ou non, une nourriture enrichie en OFS. Les résultats obtenus ont effectivement mis en évidence une modification du métabolisme hépatique des triglycérides caractérisée par une diminution de leur taux de synthese, de leur sécrétion.

L'influence de l'OFS sur la susceptibilité des hépatocytes à l'effet hépatotoxique a été étudiée. Le caractère hypolipémiant de l'OFS rendait particulièrement intéressante l'étude des effets de substances stéatogènes après traitement des animaux à l'OFS. Quatre substances stéatogènes ont été testées : la tétracycline (0,1 mM), le valproate de sodium (1 mM), le BHT (0,1 mM) et l'aflatoxine B1 (0,0 1 mM). L'aflatoxine, le valproate de sodium et le BHT n'induisent pas d'accumulation intracellulaire de triglycérides dans les hépatocytes provenant d'animaux nourris à l'OFS. Nous avons donc démontré une interaction positive (réduction de l'effet stéatogene) entre l'ingrédient alimentaire (l'oligofructose) et la potentialité toxique de substances chimiques.

Ce travail permet d'envisager une meilleure évaluation de la toxicologie nutritionnelle car :
- il propose d'évaluer la potentialité toxique par la mesure de modifications métaboliques précoces qui permettent de prévoir un effet toxique ultérieur ;
- il fait appel à une méthodologie in vitro pour l'identification de ces modifications et une méthodologie ex vivo pour la mise en évidence des interactions nutritionnelles ;
- il démontre pour la première fois qu'un ingrédient alimentaire pourrait exercer un effet protecteur vis-à-vis d'une toxicité fréquente : celle qui se traduit par une stéatose.

La mise en évidence de la stéatose requiert le développement d'un modèle qui permet à la fois une analyse biochimique et histochimique. La dernière partie du projet a été consacrée au développement et à la validation du modèle in vitro des tranches de foie pour l'analyse de la stéatose, un modele tres intéressant car, notamment, adaptable à l'analyse des tissus humains.

Au terme d'une telle recherche, il deviendrait alors possible de proposer, d'évaluer au niveau humain, le rôle protecteur potentiel d'une alimentation fonctionnelle contenant de tels ingrédients. On pourrait, enfin, proposer la stratégie élaborée dans le cadre du présent projet pour étudier d'autres types d'interactions nutrition-toxicité.

C. Alimentation fonctionnelle

C2. Allergies et intolérances alimentaires : 
effet préventif des polyamines 
(spermine et spermidine) ingérées

Prof. G. Dandrifosse, ULg - Sart Tilman, Faculté de Médecine, Bioch. et Physiol. gén., 
Institut de Chimie - 4000 Liège

Le projet de recherche, que nous avons tenté de mener à bien, comportait les tâches suivantes :
1. Détermination du contenu en polyamines de laits artificiels, humains et animaux.
2. Étude de l'effet de l'ingestion de polyamines (spermine, putrescine) sur la maturation du pancréas et du foie.
3. Étude de l'effet de l'ingestion de putrescine sur la maturation de l'intestin.
4. Mesure de la vitesse du transfert de protéines à travers l'intestin de rats adultes ou de rats non sevrés traités ou non à la spermine.
5. Étude de l'influence de polyamines contenues dans le lait sur la perméabilité intestinale aux protéines chez des enfants prématurés ou non.
6. Analyse de l'ontogenèse du système immunitaire muqueux chez le rat non sevré ingérant ou non des polyamines.
7. Effets de l'ingestion de polluants alimentaires par la rate allaitante sur des paramètres caractérisant l'intestin et le foie des ratons.
8. Analyse du mécanisme d'action de la spermine.
9. Étude épidémiologique.
10. Action curative de l'ingestion de polyamines vis-à-vis de l'intensité des réactions présentées par des patients souffrant d'allergies alimentaires.

Les tâches 9 et 10 ont été ajoutées pendant la réalisation du projet de recherche.

Les résultats et conclusions principaux suivants ont été obtenus :

L'ingestion de putrescine ne modifie pas le degré de maturation de l'intestin chez le rat. Par contre, la prise orale de spermine induit ce phénomène chez cet animal. Ce résultat a été confirmé par deux la boratoires indépendants du nôtre. Ainsi, l'addition de spermine à l'alimentation des rats non sevrés contrôle la perméabilité de l'intestin aux macromolécules. Cette observation a été vérifiée par un laboratoire différent du nôtre. L'ingestion de spermine provoque la maturation du foie et du pancréas. Elle module des propriétés immunitaires. Ces résultats sont tous en faveur de l'hypothèse suivant laquelle la spermine alimentaire pourrait jouer un rôle préventif de l'apparition des allergies alimentaires.

Cette dernière hypothèse est en cours de vérification.

Ainsi, la concentration en polyamines du lait humain a été mesurée chez 60 femmes pendant une période s'étendant depuis la première semaine de lactation jusqu'au 6ème mois de celle-ci. La concentration en polyamines de 18 poudres de lait pour bébé a été déterminée. Les contenus en spermine et en spermidine de ces poudres sont nettement plus faibles que ceux du lait humain. Ces conclusions ont été vérifiées par quatre laboratoires étrangers. Comme on a montré que la fréquence des allergies alimentaires est plus grande chez les bébés ayant reçu du lait en poudre que chez les autres bébés, ces résultats confortent l'hypothèse suivant laquelle la spermine et la spermidine ont un effet protecteur vis-à-vis de ces affections.

Nous avons entrepris une étude de la perméabilité intestinale à l'a-lactalbumine chez des bébés recevant du lait soit riche, soit pauvre en polyamines. Les résultats obtenus prouvent que la perméabilité aux macromolécules des bébés nourris au lait maternel est différente de celle des bébés nourris au lait artificiel. Ils suggèrent également que cette perméabilité est influencée par l'addition de spermine et de spermidine au lait en poudre.

Une étude épidémiologique a été organisée. Nous n'avons pu l'effectuer qu'à petite échelle. En conséquence, les résultats obtenus ne permettent pas de formuler de conclusions formelles. Seule une tendance (non significative) confirme que les enfants nourris au lait en poudre sont plus souvent allergiques que les autr

es et indiquent que les enfants ayant reçu du lait maternel riche en polyamines sont moins souvent allergiques que les enfants ayant ingéré un lait maternel pauvre en polyamines.

Nous avons aussi entrepris l'examen de l'effet de la spermine et de la spermidine sur la différenciation et la prolifération de lymphocytes (isolés à partir d'amygdales prélevées chez de jeunes enfants à des fins thérapeutiques) cultivés in vitro soit en présence, soit en l'absence d'un allergène alimentaire. Les observations réalisées prouvent que la spermine stimule la prolifération et la différenciation de lymphocytes T isolés et cultivés en présence de phytohémagglutinine L.

Par ailleurs, chez le rat, le mécanisme d'action de la spermine au niveau de l'intestin, du foie et du pancréas a fait l'objet de nombreux travaux. Cette substance agit soit directement sur les entérocytes, soit indirectement sur ceux-ci et sur des cellules du foie et du pancréas (activation de la sécrétion d'ACTH, de corticostérone et de cytokines). Dans nos conditions expérimentales, la spermine administrée aux ratons n'induit pas de lésion cancérogène.

Afin d'étudier l'action curative de l'ingestion de polyamines vis-à-vis de l'intensité des réactions présentées par de patients souffrant d'allergies alimentaires, nous avons mesuré la perméabilité intestinale aux macromolécules chez des enfants souffrant de différentes maladies intestinales. Dans ce but, des “pellets “(granulés) gastro-résistants contenant de l'a-lactalbumine humaine ont été préparés. Les résultats préliminaires obtenus montent que la technique de mesure de la perméabilité intestinale aux macromolécules, mise au point en utilisant ces pellets, permet de confirmer l'existence d'une allergie alimentaire chez l'enfant et de suivre le traitement appliqué.

L'ensemble de ces résultats et d'autres non cités ci-dessus indiquent qu'il est très probable que la spermine et la spermidine soient des agents préventifs des allergies alimentaires. Néanmoins, avant de proposer d'ajouter ces substances aux laits en poudre pour bébés ou d'augmenter la concentration du lait maternel en ces substances, il est essentiel d'appuyer nos conclusions par une étude internationale impliquant une masse critique suffisante de laboratoires indépendants.

D. Consommation alimentaire

D1. Programme de contrôle de l'alimentation

Prof. H. Deelstra, UIA, Fac. Geneeskunde & Farmacie, Lab. voor Bromatologie, 
Universiteitsplein 1, 2610 Wilrijk

Prof. D.L. Massart, VUB, Fac. Geneesk., Dienst Farmaceutische en Biomedische analyse,
Laarbeeklaan 103, 1090 Brussel

Prof. C. Van peteghem, RUG - Fac. Farmacie, Lab. voor Bromatologie, Harelbekestraat 72, 9000 Gent

Les ambitions de ce projet étaient doubles. Il y a eu tout d'abord la détermination de la concentration de certains éléments dans les aliments en Belgique : d'une part les éléments anorganiques, c-à-d 14 minéraux et oligo-éléments, d'autre part, les éléments organiques, soit la teneur totale en lipides et le profil en acides gras. Il a fallu, pour obtenir des résultats fiables, mettre au point un plan détaillé de garantie de qualité. Dans une deuxième phase, des techniques mathémiques et statistiques ont été développées, afin de pouvoir dégager des conclusions pertinentes à partir de la masse des résultats obtenus. Grâce à ces techniques mathématiques, il est en outre possible d'établir, sur la base des données relatives à l'incidence du cancer en Belgique et dans d'autres pays européens, un lien entre les aliments consommés, les éléments analysés, présents dans ces aliments, ainsi que leur ingestion quotidienne.

Les divers paramètres du programme de garantie de la qualité ont fait l'objet d'une étude approfondie. Une stratégie de validation a été mise au point sur la base de paramètres de performance clairement définis et spécifiés. Un logiciel convival a été développé pour la validation des diverses méthodes spectrométriques d'absorption atomique. Avant de procéder aux analyses spécifiques, les méthodes d'analyse ont été soumises à une évaluation détaillée.

Trois groupes d'échantillonnages ont été constitués pour l'analyse des ingrédients des produits alimentaires et de l'interprétation des résultats. En l'absence d'informations récentes à propos de la consommation en Belgique, l'évaluation de l'ingestion quotidienne en Belgique de certains ingrédients repose sur des échantillons doubles de menus de 24 heures. Des menus de 24 heures ont été rassemblés à cinq endroits différents et durant une période de sept jours. Un programme d'échantillonnage distinct, reposant sur l'étude BIRNH (Belgian Interuniversity Research on Nutrition and Health) a été conçu pour l'étude de la teneur totale en lipides et du profil en acides gras. Des produits alimentaires individuels, responsables d'au moins 90% de l'ingestion quotidienne de lipides, soit au total près de 150 produits, ont été analysés.

Les minéraux et les oligo-éléments étant présents dans pratiquement tous les aliments, ces derniers ont été regroupés dans 16 catégories. Environ 300 produits alimentaires individuels ont été sélectionnés dans ces diverses catégories pour l'analyse des minéraux et des oligo-éléments.

Les résultats des analyses portant sur les minéraux et les oligo-éléments ont été discutés à la fois dans le cadre des menus de 24 heures et dans celui des produits alimentaires individuels. La comparaison entre l'ingestion quotidienne et les normes belges et internationales permet d'établir qu'il n'existe aucun problème toxicologique en ce qui concerne les cinq éléments non essentiels : cadmium, plomb, arsenic, aluminium et chrome. Quant aux minéraux et oligo-éléments essentiels, il n'y a pas de carence pour ce qui est de l'ingestion de cuivre, de manganèse et même de potassium et de sodium. Un problème grave est posé par l'ingestion insuffisante de calcium et de fer par les femmes. L'ingestion de magnésium, de zinc et de sélénium est marginale. Une comparaison interne de l'ingestion de ces quatre éléments anorganiques répartie sur les quatre série de menus de 24 heures révèle des écarts sensibles, imputables au choix des produits alimentaires et à leur éventuel mode de préparation. Une étude comparative de l'ingestion observée dans ce projet avec les quantités calculées à partir des tables de composition des aliments de différents pays démontre que la prudence s'impose.

La teneur en lipides et le profil en acides gras ont été déterminés dans les 150 produits alimentaires individuels sélectionnés, responsables, selon l'étude BIRNH de 90% de l'apport en lipides, ainsi que dans les menus de 24 heures. Les résultats indiquent qu'en Belgique, l'ingestion totale de lipides est très élevée, soit 42% de l'apport énergétique total. Les principales catégories d'aliments responsables sont les "graisses, huiles et sauces" (50%), la "viande et la volaille" (22%), et le "fromage et les oeufs" (9%). Une étude de la part des différents acides gras dans l'ingestion totale des lipides montre que les acides gras saturés, mono-insaturés et poly-insaturés représentent respectivement 17%, 14% et 8% de l'apport énergétique global. La comparaison dans les différentes provinces de l'ingestion des diverses catégories d'acides gras révèle que des écarts existent entre la Flandre et la Wallonie, mais également entre les différentes provinces.

L'ingestion moyenne des acides gras dans les quatre endroits où ont été rassemblés des doubles de menus de 24 heures suit une tendance identique à celle calculée sur la base de l'étude BIRNH. Une comparaison avec les normes internationales démontre que l'ingestion totale relative en Belgique des lipides est largement supérieure à la valeur recommandée, oscillant entre 15 et 30%.

Les mêmes constats s'imposent en ce qui concerne les graisses saturées, soit 16,6% au lieu de 10%. L'ingestion d'acides gras poly-insaturés est en revanche relativement élevée, soit 7,6% au lieu de 3-7%. Une comparaison avec les récentes recommandations UE révèle qu'aucune carence n'existe en ce qui concerne les acides gras n-6 : 90% de la population en consomme davantage que la valeur PRI. L'ingestion d'acides gras n-3 reste cependant relativement faible. En moyenne, 37% de la population reste en deçà de la valeur PRI.

Pour établir un lien éventuel entre l'ingestion des ingrédients étudiés avec l'alimentation et les incidences sur les différents types de cancer, il a été procédé à deux études détaillée de la littérature consacrée respectivement aux lipides et aux acides gras et aux minéraux et oligo-éléments. Ces études de la littérature permettent d'établir un lien certain entre une forte consommation de lipides et les cancers du sein, du colon et de la prostate. Il apparaît en outre que des teneurs trop élevées en acides gras n-6 peuvent être associées à divers types de cancer, tandis que les acides gras n-3 assument une fonction protectrice. En ce qui concerne les minéraux et les oligo-éléments, l'étude de la littérature montre qu'une ingestion accrue de calcium, de zinc et de sélénium contribuerait à la prévention du cancer, alors qu'une teneur trop élevée en sodium pourrait indirectement provoquer un cancer de l'estomac. La comparaison de la littérature avec les résultats de la présente étude relatifs à l'ingestion de lipides, acides gras, minéraux et oligo-éléments conclut à une consommation trop élevée de lipides en Belgique, une forte consommation d'acides gras n-6 et une consommation insuffisante d'acides gras n-3. Pour ce qui est des minéraux et des oligo-éléments, il existe des insuffisances en calcium, zinc et sélénium.

Les techniques à variables multiples ont tenté d'établir une corrélation entre certains types de cancer et les habitudes alimentaires. Il est impossible de passer en revue l'ensemble des résultats, et seuls quelques exemples seront cités. Les données européennes révèlent ainsi que la Belgique arrive en tête en ce qui concerne une série de types de cancer (colon, sein,...). De plus, l'alimentation belge se caractérise par une consommation élevée de graisses animales et une faible consommation de légumes et de céréales. Les données belges sont également riches d'enseignements. Elles indiquent que les types de cancer varient dans les différentes régions du pays et que ces différences ne se limitent pas à l'axe nord/sud. Les données belges montrent notamment que la mortalité la plus forte des cancers du colon et du rectum se situe en Flandre orientale et occidentale, où la consommation de viande est importante et celle de légumes faible, tandis que les cancers du larynx/oesophage dominent dans le Hainaut où la consommation de boissons alcoolisées est la plus élevée.

Les données relatives à la consommation datent des années '80-'85 (étude BIRNH), celles concernant la mortalité datent de 1989 et il a dès lors été difficile d'établir des corrélations entre les résultats des analyses effectuées en Belgique et l'incidence sur le cancer. On estime à environ 10 ans, le délai entre l'induction par l'alimentation et l'apparition du cancer.

Les recommandations issues de ce projet s'adressent à l'ensemble des acteurs qui, à différents niveaux, sont responsables d'une politique optimale en matière d'alimentation et de santé. Outre l'étude de la présence des ingrédients analysés ici, il reste de nombreux autres composants alimentaires, associés à l'apparition ou à la prévention du cancer, à étudier. Il faut une actualisation permanente des statistiques de morbidité et de mortalité. Sur le plan technique, seules des techniques validées doivent être utilisées pour compléter les tables de composition des aliments. L'utilisation de techniques à variables multiples doit être encouragée. Des sondages d'opinion à propos de la consommation alimentaire doivent être effectués régulièrement, parmi l'ensemble de la population belge. Des campagnes de sensibilisation sont nécessaires afin de corriger le comportement alimentaire dans le cadre de la prévention des maladies. Les responsables de la production alimentaire doivent prendre en compte les résultats sans cesse affinés sur les liens entre l'alimentation et la maladie.

Une campagne d'information destinée aux jeunes et aux consommateurs doit être menée pour leur apprendre à déchiffrer et à comprendre les informations reprises sur les étiquettes des produits alimentaires.

D. Consommation alimentaire

D2. Belgian Extension on Nutrition Education and Data Input, Control, Training, Exchange (BENEDICTE)

Dr. Van Havere, Ministerie Volksgezondheid, Eetwareninspectie, Rijksadministratief Centrum,
Pachecolaan 19 / bus 5, 1010 Brussel

Les objectifs de ce projet de recherche "Belgian Extension on Nutrition Education and Data Input, Control, Training, Exchange" du programme d'impulsion "Les risques pour la santé liés à l'alimentation" sont les suivants :
- extension de la table de composition des aliments par l'ajout de données chiffrées de qualité, obtenues par des analyses concernant des données nutritionnelles encore manquantes
- extension de l'environnement informatique (logiciel et matériel) (valable également pour les autres pays européens), indispensable pour l'exploitation future de la table de composition des aliments
- mise au point de logiciels et d'ensembles et/ou de publications sur mesure, destinés aux utilisateurs potentiels
- organisation de sessions de formation pour une utilisation efficace des logiciels développés.

Ce projet a permis de mettre en lumière la nécessité d'une coopération accrue entre les pouvoirs publics, les chercheurs et l'industrie (industrie alimentaire et distribution) pour le développement scientifique ultérieur de la banque de données relative aux nutriments et aux aliments

Ce projet a constitué un réel encouragement à une collecte structurée et scientifique des données obtenues.

La réglementation concernant la valeur nutritive -mention obligatoire sur les produits alimentaires préemballés (AR du 8 janvier 1992) représente une importante référence.

Dans ce cadre réglementaire, l'industrie peut apporter une précieuse contribution par la communication de données validées, afin de pouvoir les intégrer dans la table NUBEL. Les résultats d'analyse fournis par les laboratoires agréés et validés par le Conseil scientifique, doivent dès lors pouvoir être mis à la disposition de l'industrie et reconnus par celle-ci.

Il ne faut pas oublier que le destinataire final de ces informations reste le consommateur.

Grâce à l'étiquette, il pourra s'informer sur la composition de son alimentation.

Les résultats d'analyses obtenus ont permis à NUBEL de fournir des informations objectives et scientifiques pertinentes :

- aux utilisateurs potentiels, soit l'industrie alimentaire et la distribution, qui demandaient une série d'informations

- à l'enseignement, dans le but d'informer et de dispenser une éducation sanitaire visant à l'acquisition d'une alimentation saine.

Une banque de données aux bases solides concernant les nutriments représente par conséquent un instrument utile pour la conduite d'une politique de l'alimentation cohérente.

En Belgique, le Conseil national de l'Alimentation vient de terminer ses recommandations sur les nutriments. Le projet Benedicte du programme d'impulsion "risques pour la santé liés à l'alimentation" les complète parfaitement : expliquer la composition des aliments pour permettre un choix optimal, dans le cadre d'une alimentation saine et équilibrée.

Une coopération parfaitement structurée entre les différents responsables politiques est incontournable.

Si la Belgique entend mener une véritable politique de l'alimentation, les services responsables aux niveaux fédéral et régional devront coopérer. Grâce aux efforts remarquables consentis par NUBEL, les instances régionales apprécient à leur juste valeur la table de composition des aliments et son programme d'application "Plan d'alimentation". Bien qu'étant une instance nationale, NUBEL est active auprès des services régionaux.

Le projet FLAIR "Eurofoods-Enfant" a permis à la Belgique de rattraper un énorme retard sur le plan européen. De plus, le projet BENEDICTE a été à l'origine de ce succès. Un système de gestion "NIMS", qui a connu un prolongement européen à travers EURONIMS a pu être réalisé grâce à ce projet.

Les échanges fructueux entre les deux projets ont permis à la Belgique, en l'occurence à NUBEL, d'enrichir ses connaissances tout en pouvant réduire ses efforts financiers. Il ne convient néanmoins pas se laisser aller à l'autosatisfaction : il reste encore énormément de pain sur la planche.

Nous recommandons par conséquent à la Belgique de ne pas rater cette connexion européenne à l'avenir.

NUBEL tentera de son côté de maintenir ces contacts internationaux.

En conclusion, grâce à ce projet, NUBEL a profité d'une occasion exceptionnelle pour progresser de manière significative.

Le système de gestion "NIMS", de même que les résultats d'analyse de la banque de données ont pu être réalisés dans une large mesure par l'intermédiaire de ce projet.

De plus, la publication de la table de composition des aliments représente un avancement majeur et une reconnaissance du secteur de l'alimentation.