Onderzoeksproject P5/05 (Onderzoeksactie P5)
De acht netwerkpartners werken samen rond drie voorname en samenhangende processen die vrijwel elke functie van eukaryote cellen regelen:
(1) transmembraantransport van ionen, water en neutrale moleculen;
(2) de dynamica van Ca2+ als tweede boodschapper;
(3) proteïnefosforylering in de einduitvoering van de boodschap.
1. Transport door het plasmamembraan - Het netwerk heeft twee gemeenschappelijke projecten:
1.1. In planten ondergaan H+-ATPasen een omkeerbare fosforylering die activering veroorzaakt door binding van regulatorische 14-3-3 proteïnen. De niet-conventionele fosforyleringsplaats vereist onderzoek naar de proteïnekinasen en -fosfatasen. Andere studies zullen nagaan of expressie en fosforylering van H+-ATPasen gecorreleerd zijn de met ontwikkeling en groei van planten in ongunstige omstandigheden.
1.2. Aquaporines zijn waterkanalen, maar homologe proteïnen in plant- en diercellen blijken andere moleculen te transporteren, die in samenwerking zullen geïdentificeerd worden. Sommige aquaporines worden gefosforyleerd; de fosforyleringsdynamiek en het functioneel gevolg moeten nagegaan worden.
2. Ca2+-signalen worden bepaald door de influx, vrijstelling en heropname van Ca2+:
2.1. Vier partners zullen Ca2+-intrede via TRP-kanalen gaan bestuderen: modulering van kanaalactiviteit door fosforylering en door sfingolipiden, meervoudig onverzadigde vetzuren en derivaten; identificatie van partnerproteïnen; interactie van TRP met het cytoskelet bij de assemblage van signaalcomplexen.
2.2. Ca2+ controleert Ca2+-vrijstelling via de IP3-receptor (IP3 R). Ca2+ en/of CaM-afhankelijke kinasen of -fosfatasen kunnen daarin een rol spelen: hun aandeel en hun precieze interactie met de IP3R, evenals de fosforyleringsplaatsen van de IP3R, moeten bepaald worden. Ook de mogelijkheid dat het metabolisme van IP3 zelf een doelwit is van proteïnefosforylering zal nagegaan worden.
2.3. De twee Belgische inositolfosfaat-teams zullen hun bestaande samenwerking intensifiëren, en bijkomende IP3-metaboliserende enzymen tot overexpressie brengen om de intracellulaire Ca2+-signaaldynamiek te bestuderen. Zij zullen deze techniek ook toepassen om de voortplanting van Ca2+-golven tussen cellen te bestuderen, evenals de signaaldynamiek in subcellulaire compartimenten.
2.4. De rol van het Golgi-apparaat in het genereren van Ca2+-signalen zal grondig geëxploreerd worden: de bijdrage van PIP2 zal bepaald worden door overexpressie van een specifiek 5-fosfatase; een recent ontdekte ATP-aangedreven Ca2+-pomp zal functioneel en moleculair onderzocht worden; ook de tussenkomst van sfingolipiden in Ca2+-vrijstelling via niet-IP3-mechanismen zal nagegaan worden.
2.5. De specifieke rol van de Ca2+-ATPasen SERCA2b en SERCA2a (met zijn fosforyleerbare regulator, fosfolamban) zal bestudeerd worden bij een transgene muis die enkel SERCA2b exprimeert. Ook de reden voor de hoge vroeg-postnatale fosforyleringsgraad van fosfolamban zal onderzocht worden.
3. De controle van celfuncties door omkeerbare proteïnefosforylering:
3.1. Modulering van het insulinesignaal naar metabole paden: meerdere partners zullen samenwerken bij de zuivering, klonering en karakterisering van het proteïnekinase WISK, bij het aflijnen van de rol van PKB, en de interferentie door SHIP2. Een ander aandachtspunt is het metabolisme van methylglyoxal, een substraat voor de produktie van AGEs die bijdragen tot het ontstaan van diabetische verwikkelingen.
3.2. Identificatie van fysiologische substraten van proteïnefosfatasen: daartoe zullen cellen stabiel getransfecteerd worden met expressievectoren voor inhibitorische polypeptidedomeinen die hecht binden aan PP1 of PP2A, in een fusie met een doelwitsequens voor verschillende subcellulaire localisaties.
3.3. Fosfolipiden en de controle van de organisatie van het cytoskelet: een bestaande samenwerking heeft tot doel de fosfatasen te karakteriseren die de lysofosfatidaat-gestimuleerde defosforylering van AFK-gefosforyleerd actine katalyseren; en een consortium van andere partners heeft tot doel de ontluikende rol te exploreren van lysofosfatidaat als een algemene celregulator; daarbij kan o.m. gebruik gemaakt worden van een nieuw-gesynthetiseerd fluorescerend derivaat.
