Impulsprogramma

Gezondheidsrisico's i.v.m. voeding

(1990 - 1995)

Eindverslag

Deze tekst is een onderzoekresultaat van het Impulsprogramma "Gezondheidsrisico's - luik Voeding", uitgevoerd op initiatief van de Belgische Staat - Diensten van de Eerste Minsiter - Federale diensten voor wetenschappelijke, technische en culturele aangelegenheden (DWTC). De wetenschappelijke verantwoordelijkheid over de inhoud berust volledig bij de auteurs.

Afgezien van de problematiek aangaande een evenwichtige en/of aangepaste (gezondheidsbeschermende) voeding, dienen ook de technische innovaties op het gebied van de agrovoedingsproduktie (o.a. transformatie- en bewaringsprocédés) en de nieuwe produkten (bv. oligofructosen) getoetst te worden vanuit het perspectief van de volksgezondheid. Zo vereist een efficiënte microbiologische en epidemiologische controle niet alleen betere identificatie- en "fingerprinting" methodes voor pathogenen, maar ook antwoorden op recente uitdagingen op het gebied van bv. de produktie en distributie van verse produkten en kant-en-klaarmaaltijden.

Een ander werkterrein vormt de relatie voeding-milieuvervuiling-gezondheid. In dit kader moet niet alleen de omvang worden bepaald van de inname van schadelijke stoffen - zoals zware metalen - via de voeding, maar verdient ook een sterk opkomend probleem als voedselallergie meer aandacht.

Deze en andere aspecten zijn het voorwerp van het impulsprogramma "Gezondheidsrisico's i.v.m. voeding" (1990-1995) van de Federale diensten voor wetenschappelijke, technische en culturele aangelegenheden waarin vier onderzoekgebieden worden onderscheiden:
- Microbiologische contaminatie
- Chemische contaminatie
- Functionele voeding
- Voedselconsumptie

De resultaten van dat programma vormen de rationele basis van aanbevelingen te formuleren met name op het gebied van de volksgezondheid, de agrovoedingsproduktie en -distributie en het O&O-beleid.

Voor verdere inlichtingen over de onderzoeksprojecten gelieve contact op te nemen met de auteurs of met de DWTC:

Federale Diensten voor Wetenschappelijke, Technische en Culturele Aangelegenheden
Wetenschapsstraat 8
B-1000 Brussel
Tel.: (02) 238 34 11
Fax: (02) 230 59 12
E-mail: vdpu@belspo.be
http://www.belspo.be

Deze tekst is een onderzoekresultaat van het Impulsprogramma "Gezondheidsrisico's - luik Voeding", uitgevoerd op initiatief van de Belgische Staat - Diensten van de Eerste Minsiter - Federale diensten voor wetenschappelijke, technische en culturele aangelegenheden (DWTC). De wetenschappelijke verantwoordelijkheid over de inhoud berust volledig bij de auteurs.

Inhoudstafel

A. Microbiologische contaminatie

A1. P. Tobback:
Mathematische modellen voor risico analyse (HACCP) en totaal systeem-analyse in de levensmiddelenconservering (Gekoelde levensmiddelen met een verlengde houdbaarheid)

A2. G. Waes:
Het ontwikkelen van snelle, specifieke en sensitieve identificatiemethoden voor Listeria monocytogenes

A3. M. Devleeschouwer & P. André:
De besmetting van voedsel door Listeria monocytogenen; een evaluatie van de situatie en een studie van technische verbeteringen tijdens de aanmaak.

A4. A. Hughebaert & R. De Wachter:
Ontwikkeling van snelle methoden voor identificatie en kwantificatie van de mikrobiologische contaminatie van de levensmiddelen

B. Chemische contaminatie

B1. C. De Meester & B. Rollmann:
Uitwerking van doseringsmethodes voor de kwantificatie van mutagene en kankerverwekkende voedselcontaminanten

B2. S. Srebrnik-Friszmann:
Analyse van residu's van pesticiden en PCB's in market basket produkten en totaal dieet

B3. W. Dejonckheere:
Residu's van pesticiden In voedingsmiddelen van plantaardige oorsprong en het totaal dieet

B4. J. Staessen:
Volksgezondheid en cadmiumblootstelling via het milieu

C. Functionele voeding

C1. M. Roberfroid:
Ontwikkeling van een nieuwe methode toepasselijk op de evaluatie van de veiligheid van niet-verteerbare oligosacchariden bestemd voor de voeding

C2. G. Dandrifosse:
Allergieën en voedselintoleranties: preventief effect van ingenomen polyamines (spermine en spermidine)

D. Voedselconsumptie

D1. H. Deelstra, D.L. Massart & C. Van Peteghem:
Een actiegericht food monitoring programma

D2. R. Van Havere:
Belgian Extension on Nutrition Education and Data Input, Control, Training, Exchange (BENEDICTE)

A. Microbiologische contaminatie

A1. Mathematische modellen voor risico analyse (HACCP) en totaal systeemanalyse in de levensmiddelenconservering (Gekoelde levensmiddelen met een verlengde houdbaarheid)

Prof. P. Tobback, KUL - Fac. Landbouw, Afdeling Levensmiddelen en Microbiële Technologie
Kardinaal Mercierlaan 92, 3001 Heverlee

In deze studie werden de mogelijkheid nagegaan om aan de hand van mathematische modellen de evolutie van de microbiële en visuele kwaliteit van minimaal verwerkte andijvie gedurende de levenscyclus te evalueren.

Dit werd uitgevoerd via een case study. In de studie werden volgende punten behandeld (I) meten van de verblijftijd(spreiding) en temperatuurscondities in de koudeketen van producent tot consument, (ii) kinetiek van de microbiële groei, (iii) kinetiek van de visuele kwaliteitsevolutie, en (iv) een analyse van bestaande distributiepraktijken m.b.v. simulatie.

Tijd en temperatuurscondities van minimaal verwerkte groenten in de Belgische koudeketen werden geanalyseerd. Verkeerd temperatuurgebruik werd vastgesteld tijdens transport naar en lossen in de supermarkt, in de stockageruimte en in de koeltogen, en tenslotte in de koelkast van de consument. Verblijftijd en verblijftijdspreiding van drie categorieën van minimaal verwerkte groenten in de koeltogen van twee lokale supermarkten werden geanalyseerd met een stimulus-respons techniek.

Deze techniek werd voorgesteld om de gemiddelde verblijftijd en standaard afwijking te bepalen. Er werd vastgesteld dat meer dan 50% van de pakjes verkocht werden gedurende de eerste dag van verkoop.

De kinetiek van de microbiële groei werd eerst benaderd door het meten en modelleren van de groei van indicator organismen. Nadruk werd gelegd op selectie van het model, parameterschatting en modelvalidatie. Groei van Pseudomonas marginalis en Lactrobacillus plantarum werd gemodelleerd als een functie van tijd, temperatuur en gassamenstelling (CO2). Het was mogelijk de microbiële groei te voorspellen onder dynamische temperatuurcondities. Hierbij werd gebruik gemaakt van de model parameters bekomen onder constante condities. In contrast met de sigmoïdale groeicurve van de indicator organismen in een vloeibaar synthetisch medium, werd de evolutie van de intrinsieke microflora van versneden andijvie (pseudomonas, psychrotrofe, Gram-negatieve populatie, en mesophiel aeroob kiemgetal) beschreven met het gemodifieerde model voor belemmerde groei. Dit model werd afgeleid naar de tijd om groei te voorspellen onder dynamische condities. Voorspellen van microbiële groei onder dynamische temperatuurscondities was echter moeilijker. Na een tweede temperatuursprong werd het aantal pseudomonas en het mesofiel kiemgetal onderschat.

Er werd gesuggereerd dat deze fenomenen in verband konden gebracht worden met de complete afbraak van het plantweefsel (bvb. Bijkomende vrijzetting van voedselstoffen en verandering van de matrix) zoals naast temperatuur andere factoren de groei controleren.

De visuele kwaliteitsachteruitgang van versneden andijvie werd gemeten met kwantitatieve beschrijvende analyse. Een uitgebreide statistische analyse toonde aan dat een lineare gewogen kleinste kwadraten regressie op de door een logaritmische transformatie genormalizeerde data de meest geschikte manier was om de antwoorden van het panel te modelleren. Er werd vastgesteld dat temperatuur de belangrijkste snelheid controlerende factor is. In contrast met microbiële groei wordt de snelheid van de kwaliteitsachteruitgang van de visuele kwaliteit significant beïnvloed door de gebruikte grondstoffen (bleken).

Visuele houdbaarheid van versneden andijvie werd geëvalueerd door een onafhankelijk consumenten panel. Waar een maximum toelaatbare limiet aan microorganismen ondubbelzinnig de microbiële houdbaarheid bepaald, hangt het einde van de visuele houdbaarheid af van een proportie van het consumentenpanel dat het aangeboden staal verwerpt voor consumptie.

De verwerpingscurve werd beschreven met een logistische functie. Bijgevolg kon de visuele houdbaarheid gerelateerd worden aan een zekere daling in de gemiddelde respons van het kwantitatief panel. Voorspellen van het kwaliteitsverlies onder fluctuerende temperatuurcondities, gebruik makend van de modelparameters bekomen onder constante temperatuur was echter beperkt succesvol. Verschillen in voorspelde en geobserveerde gemiddelde panel antwoorden van het kwantitatief beschrijvend analyse panel werden toegeschreven aan zwakke modelparameterschattingen. Voorspellingen van visuele houdbaarheid door het consumentenpanel onder dynamische temperatuurcondities waren iets beter.

Gebruik makens van de hierboven beschreven modellen en model parameters, werd het effect van bestaande tijd en temperatuurcondities in de koudeketen op de microbiële en visuele kwaliteitsevolutie gesimuleerd. De gemodeleerde atmosfeer werd benaderd door een gecontroleerde atmosfeer en het synergisch effect van gassamenstelling bij lage temperatuur werd buiten beschouwing gelaten. Er werd vastgesteld dat de microbiële en de visuele houdbaarheid van versneden andijvie bewaard onder lucht niet bereikt werd onder de gemiddelde tijd en temperatuurcondities in de Belgische koudeketen. Voor een hypothetische combinatie van maximale bewaartemperaturen met maximale verblijftijd in elk deel van de koudeketen zijn zowel de microbiële als de visuele houdbaarheid overschreden vooraleer de produkten geconsumeerd worden. Reductie van de initiële microbiële belasting en een gecontroleerde gassensamenstelling van 19% CO2 (met 2% CO2) resulteerde in een verdere verlenging van de microbiële houdbaarheid.

Deze observaties bevestigen het algemene besluit dat een goede controle van temperatuur en verblijftijd noodzakelijk zijn om de kwaliteit van deze minimaal verwerkte groenten te bewaren.

Een “te gebruiken tot...” label van gekoelde levensmiddelen is zinloos en geeft enkel een vals gevoel van veiligheid en kwaliteit als verkeerd temperatuur gebruik is opgetreden. Tijd-Temperatuur-Integratoren (TTIs) worden voorgesteld om de tijd-temperatuur geschiedenis van het levensmiddel op te meten en de actuele toestand van het kwaliteits- of de veiligeheidsattribuut waarin men geïnteresseerd is weer te geven. Voor minimaal verwerkte groenten moeten eveneens andere intrinsieke en extrinsieke factoren die de microbiële groei controleren ingebouwd woeden om exact de groei van de bederfflora na te bootsen. Er werd besloten dat uitgebreider onderzoek naar de kinetiek van de microbiële groei nodig is om de geschikte Produkt Geschiedenis Integrator te ontwikkelen en te selecteren. Als alternatief werd de evolutie van de visuele kwaliteit voorgesteld als een geldige intrinsieke Product History Integrator.

Bovendien, wanneer men werkelijk overgaat tot consumptie moeten andere kwaliteitskenmerken van het levensmiddel, zoals aroma eveneens geëvalueerd worden. Op deze manier is de visuele kwaliteit niet het enige selectiecriterium.

A. Microbiologische contaminatie

A2. Het ontwikkelen van snelle, specifieke en sensitieve identificatiemethoden voor Listeria monocytogenes

Dr. G. Waes, Rijkszuivelstation, Brusselsesteenweg 370, 9230 Melle

De klassieke bacteriologische test voor het opsporen van Listeria monocytogenes in zuivelprodukten omvat een aanrijking in vloeibaar medium (2 dagen), een groei op vaste selectieve bodem (2 dagen), gevolgd door een aantal confirmatietesten die in totaal 8 à 10 dagen in beslag nemen.

De duur voor de confirmatie van de species- en genusidentiteit kan verkort worden door het gebruik van een DNA-identificatie.

Een commerciële DNA-probe test (GenProbe, San Diego, CA) werd geëvalueerd voor de identificatie van L. monocytogenes kolonies gegroeid op de agarbodem. Alle resultaten, bekomen met de DNA-probe test werden bevestigd met de klassieke biochemische en morfologische identificatiemethode. Door middel van deze zeer elegante en niet radioactieve methode wordt L. monocytogenes geïdentificeerd op een halve dag. De totale test neemt 4,5 dagen in beslag. De 4 dagen blijven nodig voor de bacteriële aanrijking.

Om kolonies, gegroeid op de agarbodem, gelijktijdig te identificeren op genusniveau (Listeria spp.) en op species niveau (L. monocytogenes) werd een multiplex PCR-methode ontwikkeld. Voor de identificatie van Listeria spp. werden twee specifieke "primers" afgeleid van de 16S rRNA sequentie. Voor de identificatie van L. monocytogenes werden de specifieke "primers" afgeleid van de gensequentie die codeert voor het "invasion associated protein". De twee geamplifieerde DNA-fragmenten, respectievelijk 1003 bp en 593 bp, werden gescheiden d.m.v. agarose gelelektroforese. De resultaten bekomen met de multiplex PCR-methode kwamen overeen met deze bekomen met de klassieke bacteriologische methode. Deze overeenkomst werd vastgesteld voor de 64 zuivelmonsters die op basis van de selectieve uitplating vermoedelijk positief waren..

Door middel van PCR is het mogelijk, niet enkel de identificatieprocedure maar ook de aanrijking te verkorten.

Vertrekkend van een zuivere cultuur kan men tot 10 L. monocytogenes bacteriën per ml detecteren. Om de gevoeligheid van PCR voor de detectie van L. monocytogenes in kaasmonsters na te gaan werd gebruik gemaakt van een kunstmatige besmetting na aanrijkingsincubatie. De PCR werd geïnhibeerd door kaascomponenten en niet door de bestanddelen van het aanrijkingsmedium. De detectielimiet varieerde tussen 10 tot 106 kolonievormende eenheden per ml, afhankelijk van de geanalyseerde zachte en halfharde kaas.

PCR kan bijgevolg slechts toegepast worden voor het verkorten van de aanrijkinsprocedure als een degelijke staalvoorbereiding wordt toegepast. Het is zelfs mogelijk om via PCR zonder bacteriële cultuur direct L. monocytogenes op te sporen in het voedingsprodukt.

Een detectiemethode voor Listeria monocytogenes in 25 ml rauwe melk werd ontwikkeld. De detectielimiet werd gesitueerd tussen 5 kolonievormende eenheden (kve) en 10 kve in 25 ml rauwe melk. De detectiemethode is gebaseerd op een chemische extractie van de melkcomponenten en een twee-staps PCR-amplificatie met twee koppels "primers" waarvan het tweede inwendig gelokaliseerd is t.o.v. het eerste. De resultaten met deze methode worden op 1 dag bekomen.

Bij het toepassen van een directe detectiemethode, stelt zich de vraag in hoeverre PCR de afgedode L. monocytogenes bacteriën detecteert. Afgedode L. monocytogenes worden door PCR gedetecteerd na behandeling met verschillende desinfectantia en bij verschillende temperaturen. De gevoeligheid van deze PCR detectie is sterk afhankelijk van de toegepaste behandeling. Oplossing van L. monocytogenes cellen in pure ethanol voor 30 dagen vermindert de PCR gevoeligheid slechts 100 maal t.o.v. niet behandelde cellen. Behandeling met 1% HCl en sterilisatie (124°C voor 15 min) verhindert PCR-detectie na 1 uur.

Omwille van de mogelijke detectie van afgedode L. monocytogenes cellen met PCR, wordt voor controle doeleinden, geopteerd voor een korte, overnacht aanrijking, gevolgd door een eenvoudige staalvoorbereiding en een PCR-identificatie. Op deze wijze wordt een 24 uur-48 uur detectietijd bekomen met een betrouwbaar resultaat.

Moleculaire typeringstechnieken laten toe een bacteriële stam te identificeren tot het subspecies niveau. Hierdoor is het mogelijk een besmettingsbron op te sporen wat van belang is bij epidemiologische studies en in de industrie.

De moleculair biologische typeringstechniek "RAPD" ("Randomly Amplified Polymorphic DNA Profile") werd uitgevoerd op 100 L. monocytogenes stammen. De RAPD-techniek is gebaseerd op een PCR met behulp van korte primers die op verschillende plaatsen in het chromosoom kunnen binden. Om de reproduceerbaarheid van deze techniek te evalueren werd deelgenomen aan de internationale WHO-ringanalyse. Uit deze studie bleek dat vooral de reproduceerbaarheid tussen laboratoria met verschillende thermocyclers en kleine variaties in PCR-bufferconcentratie een probleem stelt.

Moleculaire typering van Listeria spp. en L. monocytogenes was ook mogelijk via PCR, gebaseerd op repetitieve DNA-sequenties. Families van repetitieve DNA sequenties komen verspreid voor in het genoom van verschillende bacteriële soorten. Twee families werden aangewend, namelijk de 35 tot 40 bp repetitieve extragenische palindroom sequentie (REP) en de 124 tot 127 bp enterobacteriële repetitieve intergenische consensus sequentie (ERIC).

Door middel van REP-PCR werden stammen geïdentificeerd op een vergelijkbare manier als met serotypering en RAPD-typering. Het discriminerend vermogen van ERIC-PCR was kleiner in vergelijking met REP-PCR. Het voordeel van deze methode is zijn eenvoud, gecombineerd met een grote reproduceerbaarheid.

Er werd ook een specifieke PCR-identificatiemethode ontwikkeld voor Brucella spp. De specifieke primers werden afgeleid van de 16S rRNA sequentie na een homologievergelijking van de sequenties van Brucalla abortus en Agrobacterium tumefaciens.

A. Microbiologische contaminatie

A3. De besmetting van voedsel door Listeria monocytogenen; Een evaluatie van de situatie en een studie van technische verbeteringen tijdens de aanmaak

Dr. P. Andre, IHE, Dép. de Microbiologie, Section Bactériologie, Rue J. Wytsman 14, 1050 Bruxelles

Dr. Devleeschouwer, ULB - Biocontaminants et Microbiologie et Hygiène, Inst. de Pharmacie - CP 205/2,
Boulevard du Triomphe, 1050 Bruxelles

Prof J. Dony, ULB - Unité des Biocontaminants et risques physico-chimiques du milieu
Boulevard du Triomphe, 1050 Bruxelles

Doelstellingen

- Een eventueel verband evalueren tussen de besmetting van de kaas met Listeria monocytogenes en een hygiënefout bij de aanmaak ervan.
- Een eventueel verband leggen tussen de in het voedsel, en meer bepaald in de kazen, geïsoleerde stammen en de stammen afkomstig van gevallen van humane listeriose.
- Inhiberende stammen van Listeria monocytogenes isoleren en identificeren in smetvrije kazen en in vitro inhibitietesten uitvoeren.
- Aanbevelingen formuleren in het kader van de Volksgezondheid.

Om deze doelstellingen te bereiken, werden verscheidene benaderingen overwogen:

(a) Een studie van de besmetting van kazen met Listeria. Hierbij werden 1.902 monsters bestudeerd en kon men drie methoden vergelijken om Listeria op te sporen. De doelstellingen van dit deel waren:
- de frequentie en de graad van besmetting van de kazen evalueren.
- het verband evalueren tussen de frequentie van de besmetting en het kaastype (harde/weke).
- de plaats van de besmetting evalueren.
- het verband bestuderen tussen de besmetting met Listeria spp en de graad van fecale pollutie.

De analyse van de kaasmonsters en de identificering van de stammen werden uitgevoerd op de ULB; het IHE heeft de identificering van de stammen bevestigd en heeft de serotypie uitgevoerd.

(b) Een studie voor de karakterisering van de in België geïsoleerde stammen van Listeria monocytogenes in verschillende voedingsmiddelen en in sporadische gevallen van humane listeriose. Voor dit deel moest het IHE een nieuwe typeringsmethode ontwikkelen op basis van de polymorfie van de esterasen. Hierbij werden 832 stammen bestudeerd.

Een vergelijkende analyse door serotypie en "esterase typing" werd uitgevoerd op de twee populaties van stammen (klinische en uit de voedingsmiddelen), en er werden onderscheidingsindexen berekend. Deze studie heeft aangetoond dat de uit kazen geïsoleerde populatie van Listeria monocytogenes verschilt van de uit klinische gevallen geïsoleerde populatie. Dit kon niet worden verklaard door een verschillende secretie van de virulentiemarker PI-PLC, noch door een verschillende pathogeniteit van alle stammen in een murien model. Het "esterase typing" systeem werd bovendien voor de eerste keer toegepast door het IHE om een besmet voedingsmiddel te vinden in een geval van sporadische listeriose.

De ULB heeft 54 stammen van Listeria monocytogenes, waarvan 27 humane stammen die geleverd werden door het IHE, en 27 stammen die uit kazen geïsoleerd werden, gekarakteriseerd door een studie van de polymorfieën van de hybridisatie met de sondes van ARNr 16s of 23s op restrictieprofielen met twee endonucleasen. Deze studie werd uitgevoerd dank zij de medewerking van de ULg.

(c) Een studie waarin mogelijkheden werden gezocht om de technieken te verbeteren om de besmetting te verminderen of te voorkomen. Inhiberende stammen van Listeria monocytogenes werden gezocht in smetvrije kazen. De verschillende stammen werden geïdentificeerd en een vollediger studie over de factoren die de produktie van deze stoffen met antagonistische werking beïnvloeden, en over de kenmerken van deze stoffen, werd uitgevoerd op twee stammen. De kenmerken van deze moleculen werden vergeleken met de kenmerken van nisine.

Samenvatting van de aan de ULB uitgevoerde onderzoeken

Onze studie omvatte drie delen. In het eerste deel werd de besmetting van Belgische en buitenlandse kazen met Listeria monocytogenes geëvalueerd. In het tweede deel werd geprobeerd een techniek voor karakterisering van de stammen door ribotypering aan te passen voor Listeria monocytogenes. En in het laatste deel werden bacteriële stammen gezocht die de groei van L. monocytogenes kunnen inhiberen en werden de antagonistische delen van deze stammen gekarakteriseerd.

Om de doelstellingen van het eerste deel van de studie te kunnen bereiken, hebben wij drie methoden voor de detectie van Listeria aangepast en vergeleken: de methode met rechtstreeks onderzoek, de methode met dubbele aanrijking en de methode met koude aanrijking.

De serologie en de bevestiging van de identificering van de stammen van L. monocytogenes werden uitgevoerd in het Nationaal Onderzoekscentrum voor Listeria aan het IHE (Dokter P. ANDRE). In het tweede deel hebben wij de restrictieprofielen van stammen van L. monocytogenes met de endonucleasen EcoR1 en Hindlll bestudeerd. Wij hebben op deze restrictieprofielen een ribotypering door hybridisatie met de sondes van ARNr 16S van Bacillus subtilis en van ARNr 23S van Clostridium perfringens uitgevoerd. Dit deel van het experiment werd uitgevoerd in het laboratorium voor Microbiologie van de diergeneeskundige faculteit van de Universiteit van Luik (Professor KAECKENBEECK en Dokter G. DAUBE). In het derde deel van de studie hebben wij inhiberende stammen geïsoleerd uit niet met Listeria sp besmette kazen. Daarna hebben wij de antagonistische eigenschappen onderzocht van de stammen waarvan de inhibering noch aan de produktie van zure metabolieten, noch aan de produktie van waterstofperoxide te wijten was.

In het eerste luik van de studie hebben wij voor drie verschillende perioden 1.902 kaasmonsters (1.520 Belgische en 382 ingevoerde) geanalyseerd. Listeria sp. werd geïsoleerd in 446 monsters (23,4%) en Listeria monocytogenes werd geïsoleerd in 159 monsters (8,4%). Wij hebben na verloop van tijd een daling van de graad van besmetting met L. monocytogenes vastgesteld. De besmetting daalde immers van 11% (periode van juni 1988 tot september 1990) tot 6,9% (periode van maart 1991 tot februari 1992) en uiteindelijk tot 6,4% (periode van april 1992 tot februari 1993). In de loop van het jaar 1995 werden 52 nieuwe kaasmonsters geanalyseerd. Uit deze laatste monsterneming kon onder meer worden afgeleid dat één producent nog altijd besmette kaas levert. De vaakst geïsoleerde twee types van Listeria zijn L. innocua en L. monocytogenes. Het serotype 1/2a van L. monocytogenes vertegenwoordigde 77,9% van de stammen van deze soort en het serotype 4b 12,6%.

De weke kazen zijn het meest besmet. De besmetting is voornamelijk gesitueerd in de buitenste lagen van de kaas of over de volledige kaas. Er werd bovendien een significant verband aangetoond tussen de besmetting met Listeria en de aanwezigheid van fecale coliformen. Het aantal L. monocytogenes varieerde naargelang van de monsters van minder dan 100/g tot 106/g

Voor de typering van de stammen van Listeria vertonen de restrictieprofielen met de twee endonucleasen een te groot aantal banden om gemakkelijk te kunnen worden gebruikt. Ribotyperingen met een restrictie met het enzym EcoR1 en een hybridisatie met de sonde van ARNr 23S van C. perfringens of een restrictie met het enzym Hindlll en een hybridisatie met de sonde van ARNr 16S van B. subtilis hebben de beste scheidingen van de stammen opgeleverd, vooral dan in combinatie met serotypering. In vergelijking met het gebruik van alleen maar serotypering, hebben wij met deze techniek een relatief homogene en aanhoudende besmetting kunnen aantonen in twee kazen van dezelfde producent, terwijl een derde kaas een meer heterogene besmetting vertoonde.

Ribotypering is dus een techniek die goede diensten kan leveren voor studies van de besmetting van voedingsmiddelen.

In het derde deel hebben wij uit 1.320 geteste stammen, 25 stammen geselecteerd waarvan de inhiberende eigenschappen interessant lijken. Het zijn 22 stammen van Enterococcus faecalis, 2 stammen van Lactococcus lactis en 1 stam van Pediococcus pentosaceus. Eén stam van E. faecalis en de stam van P. pentosaceus werden geselecteerd voor de studie van de eigenschappen van hun antagonistische gedeelte. Er werden verscheidene parameters bestudeerd: voorwaarden voor de produktie van de antagonist, zijn gevoeligheid voor proteasen en voor warmte en de invloed van de pH-waarde en van de caseïne op de activiteit. Deze studies hebben aangetoond dat twee moleculen eigenschappen van bacteriocines bezitten. Net zoals nisine, zijn het bactericide en thermostabiele bacteriocines. In tegenstelling met nisine, hebben ze een relatief beperkt spectrum. De produktie van het antagonistische gedeelte door de Enterococcus hangt af van een plasmide. De pogingen om deze plasmide over te dragen op stammen van melkbacteriën hebben echter geen resultaten opgeleverd.

We raden aan de besmetting van voedingsmiddelen met Listeria monocytogenes regelmatig te controleren. In geval van kazen, moet vooral aandacht worden besteed aan weke kazen. De kazen zouden allemaal niet meer met rauwe melk, maar met gepasteuriseerde melk moeten worden gemaakt. De verbetering van de hygiëne bij de produktie moet gebaseerd zijn op de installatie van een HACCP systeem (hazard analysis critical control point) en op de studie van snelle en genormaliseerde detectiemethoden die aangepast zijn voor elk pathogeen en voor elk voedingsmiddeltype.

De kaas zou beter kunnen worden beschermd door het gebruik van zuivere bacteriocines tijdens de rijping, dan door het gebruik van de antagonistische stammen zelf. Een andere methode zou het gebruik kunnen zijn van melkbacteriën, de natuurlijke stammen van de rijping van de kaas, waarop de plasmiden voor de produktie van bacteriocines overgedragen zouden zijn.

Samenvatting van de op het IHE uitgevoerde onderzoeken

Wij hebben stammen van Listeria monocytogenes geanalyseerd die in België geïsoleerd werden in verschillende voedingsmiddelen en in sporadische gevallen van humane listeriose. De verdeling van de stammen volgens hun serovar was verschillend voor beide populaties. De stammen die afkomstig waren van kazen en de stammen uit humane listeriose werden meer gedetailleerd bestudeerd aan de hand van een typeringsmethode die in de loop van dit programma ontwikkeld werd.

Wij hebben de esterasen van L. monocytogenes geanalyseerd door elektroforese in zetmeelgel. Er werden vijf esterasen geïdentificeerd, genummerd van EST 1 tot EST 5, in dalende orde van migratie naar de anode. EST 1, EST 3, EST 4 en EST 5 zijn zeer actief ten opzichte van propionaat-a-naftyl, terwijl EST 2 voornamelijk acetaat-a-naftyl hydroliseert. Inhibitiestudies suggereren dat deze vijf esterasen carboxylesterasen zijn (EC 3.1.1. 1), maar EST 1 en EST 3 worden eveneens lichtjes geïnhibeerd door parahydroximercuribenzoaat. Elk van deze esterasen bezit een elektroforetische polymorfie die gebruikt werd om een nieuwe typeringsmethode (esterase typing) te ontwikkelen. Er werden 20 elektroforetische profielen van esterasen gedefinieerd binnen de populaties van stammen afkomstig van kazen en sporadische gevallen van humane listeriose. De stammen waarmee deze 20 types overeenkomen, zijn niet uniform verdeeld in de twee populaties. Dit verschil in de verdeling van de stammen kon niet verklaard worden door secretieverschillen van de virulentiemarker fosfatidylinositol-specifieke fosfolipase C, noch door het pathogeniteitsniveau van deze stammen bij immunosuppressieve muizen. De discriminatie-index van de typering op basis van de polymorfie van de esterasen (DI=0,868) werd vergeleken met de DI bij serotypering (DI=0,666) en met de DI bij een combinatie van deze twee methoden (DI=0,8991).

A. Microbiologische contaminatie

A4. Ontwikkeling van snelle methoden voor identificatie en kwantificatie van de mikrobiologische contaminatie van de levensmiddelen

Prof. A. Huyghebaert, RUG, Fak. Landbouwwetenschappen, Technologie levensmiddelen, 
Coupure links 653, 9000 Gent

Prof. R. De Wachter, UIA, Dep. Biochemie, Universiteitsplein 1, 2610 Wilrijk

De laatste 15 jaar is de belangstelling voor Campylobacter spp. binnen de levensmiddelenindustrie enorm toegenomen. Immers is het aantal vastgestelde infecties veroorzaakt door opname van Campylobacter via het voedsel jaar na jaar gestegen. In sommige Westerse landen overstijgt het aantal gemelde gevallen van campylobacteriose zelfs het aantal gevallen van salmonellose en shigellose samen. Campylobacters maken deel uit van de normale darmflora van warmbloedigen, waaronder runderen, varkens, schapen en pluimvee. Tijdens het slachtproces en de verdere verwerking kan kruisbesmetting optreden. Geschat wordt dat tot 100% van alle kip- en gevogelteproducten in de handel gecontamineerd zijn met campylobacters. Door onvoldoende verhitting of kruisbesmetting kan de consument geïnfecteerd worden; de infectiedosis voor Campylobacter is daarenboven zeer laag (ongeveer 500 cellen).

Bij de screening van een groot aantal kip- en gevogelteproducten, afkomstig uit slachterijen en de groot- en detailhandel, konden uit meer dan 30% van de stalen Campylobacter spp. gesoleerd worden. Het merendeel werd geïdentificeerd als C. jejuni. Daar de conventionele detectiemethoden voor Campylobacter spp. tijdrovend en arbeidsintensief zijn, werden twee commercieel beschikbare DNA testkits voor de bepaling van Campylobacter in levensmiddelen geëvalueerd op snelheid, specificiteit en gevoeligheid. Beide kits vertoonden een bijna 100%-ige specificiteit, doch voor het bekomen van een positief signaal bleken minstens 107 Campylobacter cellen per ml aanwezig te moeten zijn, m.a.w. aantallen die slechts na een langdurige aanrijking worden verkregen. De relatief snelle uitvoering van de kit (45 min. tot 3 h) wordt teniet gedaan door een 2-dagen aanrijking. Vooral een techniek voor het inkorten van de aanrijkingsperiode leek noodzakelijk. De keuze hiervoor viel op het toepassen van de zgn. immunomagnetische scheiding (IMS), een techniek waarbij micro-organismen uit een voedselstaal ge<soleerd en geconcentreerd worden door binding aan specifieke antilichamen die gecoat werden op magnetische partikels. Door toepassing van een magnetische veld kunnen deze deeltjes met de daarop gebonden organismen afgescheiden worden en hetzij traditioneel uitgeplaat, hetzij toegepast worden in snelle detectietechnieken. In dit onderzoeksproject werd gebruik gemaakt van de commerciële Dynabeads© M-280 tosylactivated die gecoat werden met het commerciële geit anti-Campylobacter antilichaam. Testen toonden aan dat er een goede binding tot stand kwam tussen de Dynabeads en het antilichaam enerzijds en tussen het antilichaam en het antigen (Campylobacter) anderzijds.

Bij het werken met Campylobacter-reinculturen in vloeibare media werd in de eerste plaats gestreeft naar een optimalisatie van de IMS-techniek door het effect van de voornaamste procesparameters te onderzoeken. Bij het nagaan van de gevoeligheid en specificiteit van het IMS-systeem met reinculturen werden opbrengsten tot 35% bekomen, terwijl onder optimale omstandigheden een detectielimiet van ongeveer 200 Campylobacter cellen werd gehaald. Bij het gebruik van IMS in gemengde culturen werd het optreden van kruisreactiviteit en aspecifieke bindingen door andere organismen vastgesteld.

De IMS-techniek werd tenslotte toegepast op 90 natuurlijk besmette kippestalen. Een voorafgaandelijke vooraanrijking en aanrijking (totaal: 7 h) werden utgevoerd, waarna de IMS-techniek, in parallel met de klassieke detectiemethode voor Campylobacter, werd toegepast. De beads werden na scheiding enerzijds uitgeplaat op een aantal selectieve isolatiemedia voor Campylobacter spp. en anderzijds toegepast in een specifiek PCR-assay. Met de klassieke detectiemethode werden ongeveer 50% van de stalen positief bevonden. De combinatie IMS - uitplating leverde slechts in 12% van de stalen een positief resultaat op, terwijl bij de combinatie IMS - PCR 63% van de stalen positief werden bevonden. Niet alleen werd door de combinatie van een specifieke concentratietechniek (IMS) met een gevoelige en zeer specifieke identificatiemethode (PCR) een groter aantal positieve stalen gedetecteerd, de resultaten werden bovendien veel sneller bekomen. Daar waar de klassieke detectiemethode ten vroegste na 72 h een nog onbevestigd resultaat geeft, wordt met de combinatie IMS - PCR binnen de 30 h, onder ideale omstandigheden zelfs binnen de 12 h, een specifiek antwoord bekomen.

De conventionele methoden die aangewend worden voor de detectie en identificatie van campylobacters zijn langdurig, arbeidsintensief en soms zelfs onbetrouwbaar. Een alternatieve snelle en gevoelige detectiemethode is de polymerase kettingreactie of PCR. In eerste instantie werd een methode ontwikkeld gebaseerd op 16S rDNA. Op basis van reeds beschikbare en nieuwe door ons bepaalde 16S rDNA sequenties werden universele PCR primers en groep-specifieke oligonucleotide probes ontwikkeld. PCR amplificatie gevolgd door hybridisatie laat een groep-specifieke detectie van enteropathogene campylobacters toe. Gezien het 16S rDNA zijn beperkingen had met betrekking tot de ontwikkeling van species-specifieke detectie, werd overschakeld op het 23S rDNA.

Er werd een methode ontwikkeld voor de specifieke detectie van Campylobacter en Arcobacter die gebaseerd is op het 23S rDNA. Op basis van een 40-tal door ons bepaalde sequenties van een variabel gebied van het 23S rDNA, werden specifieke PCR primers ontwikkeld voor de (a) groep-specifieke detectie van thermofiele campylobacters, (b) species-specifieke detectie van thermofiele campylobacters, (c) species-specifieke detectie van niet-thermofiele campylobacters, (d) groep-specifieke detectie van arcobacters, en (e) species-specifieke detectie van arcobacters.

Met behulp van de PCR primers specifiek voor de thermofiele en niet-thermofiele campylobacters, kon de identificatie plaatsvinden van klinische isolaten, die geen eenduidig beeld gaven op basis van andere analyses.

De PCR assay voor de groep-specifieke detectie van thermofiele campylobacters werd toegepast op de detectie van Campylobacter spp. in aangerijkte voedselstalen. Er werden 144 kipmonsters onderzocht waarvan ongeveer 46% positief bleek te zijn op basis van de PCR assay, terwijl ongeveer 43% positief bleek te zijn op basis van de conventionele methoden. In ongeveer 34% van de voedselstalen leverden de PCR assay en de conventionele methoden tegenstrijdige resultaten op. Verder onderzoek wees uit dat dit niet het gevolg was van een detectie van dode Campylobacter cellen door de PCR assay of door een verschil in de detectielimiet van beide methoden.

Een alternatieve methode voor de detectie van PCR producten, namelijk PCR ELISA, werd uitgetest. Het voordeel van de PCR ELISA t.o.v. de conventionele analyse van PCR producten is niet de sensitiviteit, die van dezelfde grootte orde blijkt te zijn, maar wel de mogelijkheid om een geautomatiseerde detectie uit te voeren, die een gelijktijdige verwerking van een groot aantal stalen toelaat.

B. Chemische contaminatie

B1. Uitwerking van doseringsmethodes voor de kwantificatie van mutagene en kankerverwekkende voedselcontaminanten

Dr. C. De Meester & Dr. Rollmann, UCL - Fac. de Médecine, Unité de Mutagénèse et de Teratogénèse,
Av. E. Mounier 72,1200 Bruxelles

De thermische behandeling van voedsel dat veel proteïnen bevat, levert een familie van voedselcontaminanten op die deel uitmaakt van de scheikundige klasse van de heterocyclische aromatische aminen (HAAs). Deze verbindingen hebben zeer uitgesproken genotoxische eigenschappen; sommige ervan behoren tot de krachtigste gekende mutagenen en vertoonden carcinogene eigenschappen voor knaagdieren en voor de aap. Verscheidene epidemiologische gegevens lijken erop te wijzen dat deze verbindingen etiologische agentia zouden kunnen zijn van colorectale kanker en misschien ook van andere tumorvormen.

Om deze redenen zijn nauwkeurige kwantificeringsmethoden vereist om het risico te kunnen evalueren dat de mens voedingsmiddelen eet die besmet zijn met deze stoffen. Dit probleem blijft een uitdaging, omdat de HAAs gewoonlijk slechts in zeer kleine hoeveelheden (ng/g) voorkomen in de verwarmde voedingsmiddelen, zoals gekookte vlees- of visprodukten.

Daarom moet men, vóór de analyse, complexe extractiemethoden toepassen. In het verleden werden verscheidene extractieprocedures door oplosmiddelen voorgesteld die complexe schema's inhielden, maar slechts teleurstellende recuperatieniveaus opleverden. Momenteel wordt algemeen aangenomen dat de door G.A. Gross (1990) ontwikkelde methode de betrouwbaarste is. Het voornaamste voordeel van deze methode is dat een continu werkschema gehanteerd wordt, waardoor verliezen tijdens het overbrengen vermeden worden. Toch blijft het recuperatieniveau van sommige verbindingen, zoals PhlP, onvoldoende groot. Deze extractiemethode, gebaseerd op de extractie in de vaste fase, in tandem met analyse door HPLC, is eenvoudig genoeg om algemeen te worden aanbevolen als routinemethode. Zij omvat een reinigingsfase van het monster door een opeenvolging van meerdere zuiveringsstappen waarbij gebruik gemaakt wordt van kolommen met diatomeeënaarde, kationenuitwisseling en omgekeerde fase. Er moeten verschillende standaarden worden voorzien ten gevolge van het verschil in extractiewerkzaamheid van de verschillende HAAs, met de TriMelQx als interne standaard. De kwantificering wordt uitgevoerd door HPLC met een kolom met omgekeerde fase en UV-detectie of door elektrochemie (EC).

Het doel van onze onderzoeken die begonnen werden in 1991, was de ontwikkeling van de EC-detectie om niet alleen de gevoeligheid, maar ook de specificiteit van de analyses te verbeteren.

Om deze redenen was het nodig verschillende analytische parameters die de EC-detectie kunnen beïnvloeden na scheiding door HPLC, zorgvuldig te analyseren.

De volgende parameters werden bestudeerd:
- pKa van de HAAs
- pH van het oplosmiddel
- samenstelling van de buffer
- effect van de agentia voor ionenparing - ionensterkte
- gebruik van een ternaire mobiele fase in plaats van een binaire fase - keuze van de interne standaard
- keuze van de kolom
- keuze van het elektrodenpotentiaal

Er werd bijzonder veel belang gehecht aan de vergelijkende gevoeligheden van de UV-detectie vergeleken met de EC-detectie. In de actuele fase van het project hebben wij een gevoeligheidsverhoging van de orde van 5 bekomen voor de EC-detectie. Fundamenteler gezien, werd het mechanisme van de elektrochemische oxidatie eveneens bestudeerd om de oxidatiereacties op het niveau van de elektrode te kunnen verklaren.

De parameters die de chromatografische scheiding kunnen beïnvloeden, werden eveneens bestudeerd: de werkzaamheid van de kolom met omgekeerde fase werd vergeleken met de stationaire fase waarin de kationen uitgewisseld worden. Deze resultaten werden vergeleken met de resultaten uit de capillaire elektroforese die voorgesteld werd als alternatieve methode.

Uiteindelijk werd de door G.A. Gross voorgestelde methode toegepast op verschillende voedingsmiddelen, teneinde de procedure te kunnen valideren die aanbevolen zou kunnen worden als routinemethode. De detectiegrenzen van 4 HAAs met ons UV-detectiesysteem: IQ, MelQ, MelQx en 4,8-DiMelQx vertonen veel gelijkenis, met waarden rond de 5 p mol. De scheiding van de verbindingen is bevredigend, met recuperatiepercentages tussen 70 en 80%, en met een volledige extractieprocedure van een mengsel van zuivere verbindingen. Er werden verscheidene verwarmde vleesprodukten geanalyseerd: een commercieel vleesextract, geroosterde worst en geroosterd rundsgehakt. Uit deze proeven blijkt dat de recuperatiepercentages van de gezochte HAAs nogal verschillen.

De UV-detectie werd vergeleken met de EC-detectie na scheiding door HPLC met een isocratisch oplosmiddel, en dit op 3 verwarmde vleesprodukten:
- In commercieel vleesextract werden de volgende hoeveelheden van MelQx, lQ en MelQ gevonden: respectievelijk 27,7, 17,6 en 2,9 ng/g.
- In het rundsgehakt, dat gedurende verschillende tijdsduren gekookt werd, werden de volgende MelQx, lQ en MelQ hoeveelheden gevonden na UV-detectie: respectievelijk 2,16 - 2,49 / 13,1 - 27,3 / 1,72 - 2,5 ng/g. De EC-detectie leverde zeer gelijkaardige resultaten op.
- In een commercieel mengsel van geroosterd vlees ("pita") werden de volgende concentraties van MelQx, lQ en MelQ gevonden: respectievelijk 1,97, 16,4 en 2,2 ng/g (UV-detectie) of 2,5, 18,5 en 2,7 ng/g (elektrochemische detectie).

Deze resultaten bewijzen dat een gelijktijdige detectie door UV en door EC zeer gelijkaardige cijfers oplevert. De spreiding van deze resultaten toont echter aan dat de reproduceerbaarheid van de methode verbeterd kan worden, meer bepaald voor lQ dat niet goed gescheiden is. In het huidige stadium van de onderzoeken, kunnen we besluiten dat de EC-detectie betrouwbaar is, in vergelijking met de klassiekere UV-methode, hoewel er nog verschillen blijven bestaan naargelang van de aard van het geanalyseerde monster.

De originele methode van scheiding door HPLC op kationenuitwisselingskolom (IEC) die ontwikkeld werd, vertoont verscheidene voordelen in vergelijking met de klassieke methode van scheiding op omgekeerde fase:
- een goede scheiding van de belangrijkste HAAs: lQ, MelQ, MelQx, 4,8uiMelQx en PhlP
- gemakkelijk te bereiden oplosmiddel (isocratische elutie)
- aanzienlijke vermindering van de analyseduur
- vermindering van de spreiding van de afzonderlijke pieken
- vermindering van de prijs van de vereiste kolom
- vereenvoudiging van de vereiste HPLC pomp

De IEC/EC- en IEC/UV-methoden werden anderzijds gevalideerd in de loop van een interlaboratorium-oefening over een methanoloplossing met ongekende samenstelling.

Er werd bewezen dat deze twee methoden gebruikt kunnen worden voor de routine-analyse van verwarmde voedingsmiddelen, zoals commercieel vleesextract of geroosterd rundvlees.

B. Chemische contaminatie

B2. Analyse van residu's van pesticiden en PCB's in market basket produkten en totaal dieet

Dr. S. Srebrnik-Friszman, IHE, Serv. Denrées Alimentaires, Rue J. Wytsman 14, 1050 Bruxelles

Gedurende de laatste twintig jaar werden grote hoeveelheden pesticiden gebruikt in de land- en tuinbouw. De industrie heeft bovendien aanzienlijke hoeveelheden van gechloreerde verbindingen gebruikt, waaronder polychloorbifenyl.

Dit intensief gebruik heeft een duidelijke invloed gehad op het milieu en dus op de elementen van de voedselketen.

De toxiciteit van deze produkten werd bewezen in talrijke studies. En ten gevolge van deze toxiciteit hebben de regeringen het gebruik van deze produkten willen beperken, controleren en zelfs verbieden. Ondanks deze ingrepen, is de stabiliteit van deze produkten zodanig groot dat ze nog altijd gevonden worden in het milieu. De concentraties ervan zijn wel gradueel gedaald tot op het huidige niveau dat dicht bij de detectiegrens ligt.

Deze studie wil de concentraties van organochloorpesticiden en polychloorbifenyl in verschillende courant verbruikte produkten onderzoeken en nagaan of deze concentraties nefaste gevolgen kunnen hebben voor de volksgezondheid.

Om deze doelstellingen te bereiken, werden 2.399 monsters van diverse aard geanalyseerd die representatief zijn voor het verbruik van de gezinnen. Het betrof monsters van vlees (varkens, runderen, schapen, kalveren, paarden, kippen, konijnen, fijne vleeswaren), van vis (zee- en zoetwatervis), van melk (melk en melkprodukten), van plantaardige olie (olie en margarine) en van eieren.

Bij de analyses werden slechts geringe concentraties van pesticiden gevonden. Wij hebben geen significante verschillen kunnen aantonen tussen de concentraties die bepaald werden op basis van verse voedingsmiddelen en de concentraties die bepaald werden op basis van voedingsmiddelen die een culinaire behandeling gekregen hadden. De hier vermelde resultaten zijn dan ook alleen maar gebaseerd op de niet behandelde monsters.

Om eventuele nefaste gevolgen voor de gezondheid te onderzoeken, werden de gemiddelde, de middelste en de maximale waarden van de concentraties vergeleken met de beschikbare toegelaten dagelijkse dosissen (A.D.I./Acceptable Daily Intakes). Elk resultaat werd vergeleken met de Belgische normen die van kracht waren op het moment dat de studie uitgevoerd werd (Koninklijk Besluit van 23 oktober 1991, gebaseerd op de Europese richtlijnen, Bijlagen B en tabel 3.B.). Er moet worden opgemerkt dat geen rekening gehouden werd met polychloorbifenyl bij de bepaling van de maximaal toegelaten gehalten. Dit Besluit spreekt ook niet over vissen. Op basis van de resultaten van deze studie, kunnen we besluiten dat de concentraties van organochloorpesticiden beantwoorden aan de normen van de van kracht zijnde wetgeving.

Om eventuele nefaste gevolgen voor de gezondheid te onderzoeken, werden de gemiddelde, de middelste en de maximale waarden van de concentraties vergeleken met de beschikbare toegelaten dagelijkse dosissen (A.D.I./Acceptable Daily Intakes). De A.D.I. is de hoeveelheid contaminanten die dagelijks kan worden ingenomen gedurende het hele leven, zonder nefaste gevolgen voor de gezondheid.

De tabel hieronder geeft een overzicht van de percentages van de A.D.I. voor een gemiddelde concentratie van residu's van de ingenomen pesticiden, bij een gemiddeld verbruik van voedingsmiddelen door een persoon van 60 kg.

Voor het verbruik van alle voedingsmiddelen			
Contaminanten	A.D.I. (mg/kg/dag)	Percentage van de A.D.I.	
a-HCH
b-HCH
Lindaan
Hexachloorbenzeen
Heptachloorepoxide
Dieldrin
DDT
Polychloorbifenyl 	8
8
8
6
0.1
0.1
20
5	0.070
0.110
0.158
0.167
6.354
11.591
0.134
3.000	

De waarden van de percentages van de A.D.I. tonen aan dat de aanbevelingen van de wereldgezondheidsorganisatie (WHO) en van de wereldorganisatie voor landbouw en voedsel (FAO) gerespecteerd worden. De hoogste waarden in deze tabel zijn te wijten aan de striktere aanbevelingen van de organisaties voor dit type van stoffen.

Als conclusie kan men stellen dat, op enkele geïsoleerde gevallen na, de van kracht zijnde normen voor de organochloorpesticiden gerespecteerd worden. Het percentage van de A.D.I. dat overeenkomt met de gemiddelde concentraties van residu's, en voor een gelijktijdig gemiddeld dagelijks verbruik voor alle voedingsmiddelen, is kleiner dan 11,6% van de waarden die de internationale organisaties toelaten.

Voor polychloorbifenyl is in België geen enkele norm vastgelegd. Op basis van de resultaten van de analyses, kunnen we stellen dat alle gemiddelde concentraties lager liggen dan 16,9 mg/kg voedingsmiddelen en dat de waarden voor vissen en voor melkprodukten hoger liggen dan voor andere voedingsmiddelen.

Om de vastgestelde waarden te kunnen bevestigen en eventuele verschillen te onderzoeken tussen de concentraties van organochloorpesticiden en de concentraties van polychloorbifenyl, moet een programma voor de controle van voedingsmiddelen volgehouden worden. Vooral het onderzoek van het gehalte aan polychloorbifenyl in melkprodukten en vissen zou prioriteit moeten krijgen.

B. Chemische contaminatie

B3. Residu's van pesticiden In voedingsmiddelen van plantaardige oorsprong en het totaal dieet

Prof. W. Dejonckheere, RUG - Fac. Landbouw, Lab. Fytopharmacie, Coupure Links 653, 9000 Gent

Het gebruik van pesticiden in de land- en tuinbouw wordt officieel toegestaan door de Ministeries van Landbouw en Volksgezondheid. De voorschriften bij dit gebruik zijn zodanig dat de pesticiden efficiënt kunnen toegepast worden en dat, bij de oogst van het eetbare produkt, de residu's toxicologisch aanvaardbaar zijn.

Volgens het princiep van het goed landbouwkundig gebruik is dus het gebruik van pesticiden alleen toegelaten indien hierdoor een effektieve bestrijding van ziekten en plagen bekomen wordt en indien de, op toxicologische gegevens gebaseerde, residutoleranties niet overschreden worden.

In eerste instantie werd in dit onderzoek nagegaan of plantaardige voedingsmiddelen en eventueel afgeleiden beantwoorden aan de wettelijke residutoleranties m.a.w. of bij de aankoop van deze voedingsmiddelen niet te veel residu's aanwezig zijn. Hiervoor werden, verspreid over een periode van twee jaar, van 1 april 1991 tot 31 maart 1993 in totaal 3698 stalen genomen van 21 soorten groenten, 15 soorten fruit en 7 soorten diverse.

Op deze stalen werden verschillende soorten analysen toegepast, zowel multi-methoden, waarbij verschillende pesticiden in één analyse worden aangetoond, als specifieke methoden, waarbij één bepaald pesticide wordt gedetecteerd. Voor het geheel van het onderzoek waren 12 methoden beschikbaar en konden ongeveer 130 verschillende pesticiden of metabolieten worden bepaald. Op basis van informatie, zowel wat betreft het gebruik van pesticiden als wat betreft vastgestelde residu's, werden die analysemethoden toegepast die toelaten de pesticiden te detecteren die normaal in elke teelt worden toegepast en waarvan residu's te verwachten zijn.

Het percentage overschrijdingen van de residutolerantie vastgesteld bij deze analysen is als volgt:

	% stalen niet conform wettelijke toleranties	% stalen met residu's zonder toleranties	Totaal niet conform	
Groenten
Fruit
Diverse	6,9
0,7
1,2	2,5
1,4
0	9,4
2,1
1,2	
Totaal	4,2	1,8	6,0	

De stalen niet conform met de wettelijke toleranties betreffen vooral bladgroenten waarbij de volledige plant geoogst wordt, dus met eventueel residu's van alle toegepaste pesticiden. Het risico dat hierbij de tolerantiegrens overschreden wordt is daardoor uiteraard groter dan bijv. bij tomaat of appel waar de meeste pesticiden toegepast worden om de plant gezond te houden en, in verhouding minder pesticiden op het uiteindelijk geoogst produkt terecht komen, met minder residu's als gevolg.

De stalen met residu's zonder toleranties zijn het gevolg van het gebruik van niet toegelaten middelen, dus zonder residutolerantie (eventueel kunnen deze middelen wel toegelaten zijn in buurlanden) of de aanwezigheid van residu's op in België niet geteelde gewassen (druif, appelsien, banaan) waarvoor in de produktielanden het gebruik van deze pesticiden wettelijk is toegelaten, maar de normaal aanwezige residu's niet voorkomen in de Belgische tolerantielijsten.

In tweede instantie was het de bedoeling van dit onderzoek na te gaan welke hoeveelheid pesticiden wordt opgenomen via de voeding. Hierbij werd elk voedingsmiddel, waarin bij het eerste onderzoek residu's konden aangetoond worden, behandeld zoals dit normaal gebeurt bij de bereiding vóór consumptie (wassen, schillen, koken enz.). Daarna werd een nieuwe analyse uitgevoerd en kon eventueel een tweede of een derde culinaire bewerking gebeuren gepaard gaande met een nieuwe analyse.

Hierdoor kon een inzicht bekomen worden in de daling van het residugehalte bij normale culinaire behandelingen wat voor de consument duidelijk van belang is als middel om de opname van pesticiden via de voeding te beperken.

Om de opname van de pesticiden te berekenen werden de hoeveelheid aangetoonde residu's in het voedingsmiddel klaar voor consumptie telkens omgerekend op 100 g voedingsmiddel en uitgedrukt als procent van de ADI-waarde. Dit is de toxicologisch aanvaardbare dagelijkse inname voor een persoon van 60 kg zoals vastgelegd door de Wereld GezondheidsOrganisatie (WHO) en de Wereld Voedsel- en LandbouwOrganisatie (FAO).

Om de gemiddelde opname van pesticiden via de onderzochte voedingsmiddelen te kennen is het noodzakelijk te weten hoeveel van elk van deze voedingsmiddelen dagelijks gemiddeld per persoon geconsumeerd wordt. Aangezien hierover in België geen officiële cijfers beschikbaar zijn werd zelf een benaderend overzicht gemaakt op basis van gegevens over het koopgedrag in België, afkomstig van het Nationaal Instituut van de Statistiek (N.I.S.) en het Landbouw Economisch Instituut (L.E.I.).

Vervolgens werd een keuze gemaakt uit de meest voor de hand liggende culinaire bewerking zoals sla: gewassen; wortelen: geschild, maar ook zonder bewerking zoals appel: ruw zoals bij aankoop en werd voor elk vastgesteld pesticide het procent van de ADI berekend die via de gemiddelde hoeveelheid van elk voedingsmiddel per dag wordt opgenomen.

Uiteindelijk werd voor elk pesticide het totale procent van de ADI berekend in het volledig onderzochte voedselpakket.

Globaal in de meest gemiddelde situatie, met een dagelijkse opname van het onderzochte voedselpakket:
- worden in totaal 54 verschillende pesticiden opgenomen
- is het procent van de ADI maar voor twee pesticiden hoger dan 1% nl. dithiocarbamaten (1,9%) en bromide (1,6%).

Zelfs indien, wat wetenschappelijk niet kan aanvaard worden, alle procenten van de ADI's worden samengeteld komt de totale opname maar overeen met 10,7% van de aanvaardbare opname.

Als algemeen besluit van dit onderzoek kan gesteld worden dat:
- de residutoleranties vooral op groenten en in het bijzonder bladgroenten vrij regelmatig overschreden worden
- het behandelen van groenten en fruit vóór consumptie (zoals wassen, schillen, koken) een duidelijke verlaging van de hoeveelheid opgenomen residu's tot gevolg heeft
- de reële opname van pesticiden via de voeding veel lager is dan wat toxicologisch als aanvaardbaar mag geacht worden

Hierbij zijn twee opmerkingen aangewezen:

1. Bij een gelijkaardig onderzoek in andere landen is het mogelijk dat het percentage overschrijdingen van de residutoleranties lager is dan in België. Hierbij moet duidelijk vermeld worden dat de resultaten van residuonderzoek in grote mate bepaald worden door het aantal verschillende analysemethoden die worden toegepast. Meestal worden alleen multi-methoden en in mindere mate specifieke methoden toegepast, wat in dit onderzoek wel is gebeurd (vb. antispruitmiddel chloorprofam op aardappel, bromide in bladgroenten).

2. Gezien de uiteindelijke beperktheid van de financiële middelen en de beschikbare analyseapparatuur en -methoden werden ook in dit onderzoek niet alle voedingsmiddelen onderzocht en kan niet gesteld worden dat alle, eventueel aanwezige, pesticiden werden aangetoond.

Alle resultaten van dit onderzoek zijn in detail opgenomen in 4 bijlagen die op diskette beschikbaar zijn.

De titels van deze bijlagen zijn:
1. Resultaten berekend op 100 g van elk voedingsmiddel
2. Resultaten berekend op het gemiddeld dagelijks verbruik van elk voedingsmiddel
3. Resultaten berekend op 100 g voedingsmiddel en voor elk pesticide
4. Resultaten berekend op het gemiddeld dagelijks verbruik en voor elk pesticide

B. Chemische contaminatie

B4. Volksgezondheid en cadmiumblootstelling 
via het milieu

Prof. J. Staessen, KUL, UZ Gasthuisberg, Klinisch Lab. Hypertensie, Inwendige Geneeskunde-Cardio,
Herestraat 49, 3000 Leuven

Achtergrond: De PheeCad studie is een longitudinale bevolkingsstudie die de gezondheidseffecten van blootstelling aan cadmium en lood bestudeert. De deelnemers werden bij toeval getrokken uit de bevolking van twee gebieden, zodanig gekozen dat een breed bereik van blootstelling aan cadmium kon worden onderzocht.

Cadmiumoverdracht: De opname van cadmium werd onderzocht bij 230 proefpersonen (leeftijdsbereik 20-83 jaar), die groenten aten geteeld in eigen tuin op een zure (gemiddelde pH +/- 6.3) zanderige bodem. De studie onderzocht het verband tussen de cadmiumwaarden in het bloed en de urine en de cadmiumconcentratie in de bodem (variërend van 0.2 tot 44 ppm). Zesenzeventig personen waren rokers en 122 woonden in een regio met bewezen cadmium verontreiniging. De urinaire cadmiumuitscheiding bedroeg bij alle 230 deelnemers gemiddeld 8.7 nmol/24-h (uitersten: 1.3-47 nmol/24-h) en was positief gecorreleerd met de cadmiumconcentratie in de bodem. Na correctie voor leeftijd ging een verdubbeling van het cadmiumgehalte in de bodem bij mannen gepaard met een 7% stijging (r2=0.05; p=.04) van de urinaire cadmiumuitscheiding en bij vrouwen met een 4% stijging (r2 =0.02; p=.05).

Besluitend kan gesteld worden dat bij een landelijke bevolking die groenten at geteeld op een verontreinigde bodem met licht zure en zanderinge samenstelling, 2 tot 4% van de urinaire cadmiumuitscheiding kan worden verklaard op basis van het cadmiumgehalte van de bodem.

Nierdysfunctie en blootstelling aan cadmium: De PheeCad studie onderzocht ook of er tussen 10 streken met verschillende cadmiumverontreiniging een verband kon worden aangetoond tussen glomerulaire en tubulaire nierdysfunctie enerzijds en de inwendige (gemeten in de urine) en uitwendige (gemeten in het leefmilieu) cadmiumblootstelling. Cadmium werd gemeten in de bodem en in groentestalen in 10 regios, waarvan er 6 grensden aan non-ferro smelters. Bij 703 door het toeval aangewezen inwoners (medewerkingspercentage: 78%) werden nierfunctie en metaalconcentraties in bloed en urine gemeten. De zes verontreinigde regios toonden in vergelijking met de vier andere regios, hogere cadmiumconcentraties in de bodem (4.86 vs. 0.81 ppm) en in ter plaatse gewonnen groenten, zoals selder (2.43 vs. 0.68 ppm) en bonen (0.42 vs. 0.15 ppm). Inwoners van de verontreinigde gebieden hadden een verhoogde urinaire uitscheiding van cadmium (10.5 vs. 7.9 nmol/24-h) en koper (0.16 vs. 0.14 mmol/24-h), een hoger serumcreatinineconcentratie (100 vs. 97 mmol/l) en een verhoogde urinaire uitscheiding van b2-microglobuline (109 vs. 95 mg/24-h) retinol-binding-protein (136 vs. 118µg/24h) en N-acetyl-b-glucosaminidase (1.78 vs. 1.38 U/24-h).

De creatinineklaring was verlaagd in de zes verontreinigde gebieden (87 vs. 92 ml/min). Over de verschillende gebieden was de cadmiumconcentratie in de bodem positief gecorreleerd met het cadmiumgehalte in selder (r=0.77), in bonen (r=0.67) en in de urine van de inwoners (r=0.76). De creatinineklaring was negatief gecorreleerd met de cadmiumconcentratie in de bodem (r=-0.78), in selder (r=-0.90) en in bonen (r=-0.70). De correlaties tussen de cadmiumconcentraties en 24-uur urinaire uitscheiding van microproteinen en N-acetyl-b-glucosaminidase waren positief, maar waren zwakker dan deze naargelang van de creatinineklaring.

Als besluit kan gesteld worden dat de voormalige emissies van non-ferro smelters tot op heden het leefmilieu verontreinigen met cadmium, dat doordringt tot in de voedselketen. Deze verontreiniging stelt de ganse bevolking bloot aan een verhoogd risico op nierfunctiebeperking en wijzigingen in de zink- en koperhuishouding.

Blootstelling aan anorganisch arsenicum: De blootstelling van de bevolking aan anorganisch arsenicum, een bekend carcinogeen, werd nagegaan in België door arsenicum te bepalen in 24-uur urinestalen verzameld in het kader van de CadmiBel (1985-1989) en PheeCad (1991-1995) bevolkingsonderzoeken. Eerstgenoemde studie vond plaats in geïndustrializeerde stedelijke gebieden (Luik: n=664, Charleroi: n=291), in een landelijk gebied (Hechtel-Eksel: n=397) en in een rurale zone, waarvan de bevolking mogelijk blootgesteld was geweest via de emissies van non-ferro smelters (Westelijke Noorderkempen: n=93, Oostelijke Noorderkempen: n=244). De CadmiBel resultaten tonen aan dat na correctie voor geslacht, leeftijd en zwaarlijvigheidsindex, de 24-uur urinaire arsenicumuitscheiding lager was (p<.001) in Luik (91 nmol) dan in Charleroi (155 nmol), Hechtel-Eksel (144nmol) en de Westelijke Noorderkempen (158 nmol). De hoogste 24-uur arsenicumuitscheiding werd gemeten in de Oostelijke Noorderkempen. Van 1991 to 1995, werden de landelijke gebieden (n=609) opnieuw onderzocht, samen met een stedelijk gebied (Leuven, n=152). De 24-uur arsenicumuitscheiding tijdens deze periode was in de landelijke gebieden (Hechtel-Eksel 99 nmol; Westelijke en Oostelijke Noorderkempen 97 nmol) lager dan zes jaar eerder en vergelijkbaar met de waarden opgetekend te Leuven (108 nmol). Longitudinale follow-up van 529 inwoners van het landelijk gebied toonde aan dat hun 24-uur arsenicumuitscheiding daalde (p<.001) van 222 naar 100 nmol.

Als besluit kan gesteld worden dat de industrie de meest waarschijnlijke bron was van de verhoogde blootstelling in de Oostelijke Noorderkempen in de periode van 1985 tot 1989, (1) omdat de urinaire arsenicumuitscheiding de regionale verschillen in de arsenicumconcentratie in het drinkwater niet volgde, (2) omdat de verhoogde blootstelling enkel werd waargenomen in gebieden die windafwaarts van de industriële sites lagen, (3) omdat de urinaire arsenicumuitscheiding omgekeerd evenredig was met de afstand van de woonplaats van de inwoners ten opzichte van de zinksmelter, en (4) omdat de daling van urinaire arsenicumuitscheiding met de tijd kon worden verklaard door een daling van de industriële activiteit.

Een belangrijke waarneming was dat het officiële netwerk dat arsenicum met in het zwevend en neergevallen stof geen verhoogde concentraties detecteerde in de Noorderkempen tussen 1985 en 1989. Deze bevindingen bewijzen dat het noodzakelijk is monitoring van het leefmilieu te valideren door directe metingen van van de inwendige blootstelling bij bevolkingen die mogelijkerwijze blootgesteld zijn via natuurlijke of industriële verontreiniging.

Blootstelling aan lood en bloeddruk in een longitudinale studie: Om op prospectieve wijze het verband tussen een lage blootstelling aan lood en bloeddruk te evalueren, werd van 1985 tot 1989 een staal van de Belgische bevolking onderzocht (n=728; 49% mannen; leeftijdsbereik: 20-82 jaar) en werd dit onderzoek herhaald in de periode van 1991 tot 1995. Zowel bij de start van de studie als bij de follow-up werd de bloeddruk gemeten door middel van conventionele bloeddrukmetingen (15 in totaal) en bij follow-up ook door middel van een 24-uur ambulante bloeddrukmonitoring. De blootstelling werd geschat via het gehalte aan lood en zinkprotoporfyrine in het bloed. Multivariant analyses hielden rekening met de volgende covariabelen: geslacht, leeftijd, zwaarlijvigheid, rook- en drinkgewoontes, fysieke activiteit, blootstelling in de werkplaats, sociale klasse, menopause, medicatie, hematocriet, serum-calcium en -glutamyltransferase. Aanvankelijk bedroeg de bloeddruk gemiddeld (systolisch/diastolisch ± SD) 130±17 / 77±9 mm Hg, het loodgehalte in het bloed 0.42 mmol/l (bereik: 0.08-3.50) en het zinkprotoporfyrine 1.0 mg/g hemoglobine (0.3-19.5). Na een mediane follow-up van 5.2 jaar daalde het loodgehalte (p<.001) met 0.14 mmol/l (32%). Kleine, maar statistich significante (p<.01) veranderingen werden waargenomen in de conventioneel gemeten systolische (-1.5 mm Hg) en diastolische (+1.7 mm Hg) bloeddruk en in het zinkprotoporfyrine (+0.5 mg/g hemoglobine). Tijden de follow-up kwam geen consistente verband aan het licht tussen de veranderingen in de conventionele bloeddruk en deze in loodgehalte of zinkprotoporfyrinegehalte in het bloed. Bovendien kon noch het loodgehalte, noch het zinkprotoporfyrinegehalte in het bloed bij de aanvang van de studie het ontwikkelen van hypertensie bij 47 patienten voorspellen (risicoverhouding geassocieerd met een verdubbeling van het loodgehalte in het bloed: 1.2; BI: 0.7-2.0). In een analyse waarbij elke proefpersoon gekarakterizeerd werd door alle beschikbare metingen, correleerde de conventionele bloeddruk niet met de loodconcentratie in het bloed, noch met de concentratie van zinkprotoporfyrine.

Bovendien vertoonden de 24-uur ambulante bloeddruk bij follow-up (gemiddeld 119±11 / 71±8 mm Hg, n=684) geen consistent verband met de concentratie in het bloed, van lood en van zinkprotoporfyrine.

Als besluit kan gesteld worden dat deze bevindingen pleiten tegen de hypothese dat de huidige blootstelling aan lood geassocieerd zou zijn met een toename in cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit via een verhoging van de bloeddruk. 

C. Functionele voeding

C1. Ontwikkeling van een nieuwe methode toepasselijk op de evaluatie van de veiligheid van niet-verteerbare oligosacchariden bestemd voor de voeding

Prof. M. Roberfroid, UCL - Fac. de Médecine, Unité de Bioch. Toxicol. et Cancérologique (BCTC 7369),
Av. E. Mounier 72, 1200 Bruxelles

Deze studie moet gezien worden in het kader van de ontwikkeling van nieuwe methoden voor de evaluatie van de risico's voor de gezondheid van het verbruik van nieuwe voedingsingrediënten, vooral dan van niet-verteerbare fructo-oligosacchariden. Het doel was immers een studie van de invloed van het verbruik van oligofructose op het lipide metabolisme, en op de gevoeligheid van de lever voor de steatogene werking van sommige chemische agentia die concomiterend kunnen worden ingenomen.

De toediening aan ratten van een voeding verrijkt met oligofructosacchariden (OFS) (10%) veroorzaakt een aanzienlijke daling (30-50%) van de serumconcentratie aan triglyceriden-VLDL en dit van bij het begin van de behandeling. Het onderzoek naar de hepatitische factoren die deze hypotriglyceridemie zouden kunnen veroorzaken, maakt gebruik van geïsoleerde hepatocyten van ratten die een voeding kregen die al dan niet verrijkt werd met OFS. De bekomen resultaten wezen inderdaad op een wijziging van het hepatitisch metabolisme van de triglyceriden, gepaard gaande met een vermindering van hun synthesevermogen en van hun secretie.

De invloed van OFS op de hepatoxiciteit van de hepatocyten werd bestudeerd. Het hypolipemisch karakter van de OFS maakte een studie over het effect van steatogene stoffen na een behandeling van de dieren met OFS bijzonder interessant. Er werden vier steatogene stoffen getest: tetracycline (0,1 mM), natriumvalproaat (1 mM), BHT (0,1 mM) en aflatoxine B1 (0,01 mM). Aflatoxine, natriumvalproaat en BHT veroorzaken geen intracellulaire ophoping van triglyceriden in de hepatocyten van dieren die met OFS werden gevoed. Wij toonden dus het bestaan aan van een positieve interactie (vermindering van het steatogeen effect) tussen het voedingsingrediënt (oligofructose) en het toxisch potentieel van de chemische stoffen.

Deze studie maakt een betere evaluatie van de voedingstoxicologie mogelijk, omdat:
- ze voorstelt het toxische potentieel te evalueren door de meting van de vroege metabolische wijzigingen op basis waarvan men een later toxisch effect kan voorspellen;
- ze een beroep doet op een in vitro methode voor de identificering van deze wijzigingen en op een in vivo methode voor het vastleggen van de voedingsinteracties;
- ze voor de eerste keer bewijst dat een voedingsingrediënt een beschermend effect zou kunnen hebben tegen een veel voorkomende toxiciteit die tot uiting komt door een steatose.

Voor de vaststelling van de steatose moet een model worden ontwikkeld waarmee tegelijkertijd een biochemische en een histochemische analyse kunnen worden gemaakt. Het laatste deel van het project werd gewijd aan de ontwikkeling en aan de validering van het in vitro model van de leverschijfjes voor de analyse van de steatose. Dit model is zeer interessant omdat het aangepast kan worden voor de analyse van humaan weefsel.

Na dit onderzoek zou men op humaan niveau de potentieel beschermende rol kunnen voorstellen en evalueren van een functionele voeding die dergelijke ingrediënten bevat. Men zou ook de strategie die in het kader van dit project werd uitgewerkt, kunnen voorstellen voor de studie van andere types van interactie tussen voeding en toxiciteit.

C. Functionele voeding

C2. Allergieën en voedselintoleranties: preventief effect van ingenomen polyamines (spermine en spermidine)

Prof. G. Dandrifosse, ULg - Sart Tilman, Faculté de Médecine, Bioch. et Physiol. gén., 
Institut de Chimie, 4000 Liège

Ons onderzoeksproject was gebaseerd op de volgende doelstellingen:
1. Bepaling van het gehalte van polyamines in kunstmatige, humane en dierlijke melk.
2. Studie van de gevolgen van het innemen van polyamines (spermine, putrescine) op de maturatie van de pancreas en van de lever.
3. Studie van de gevolgen van het innemen van putrescine op de maturatie van de darm.
4. Meting van de permeabiliteitssnelheid van proteïnen door het darmkanaal van volwassen ratten of van niet gespeende ratten die al dan niet behandeld waren met spermine.
5. Studie van de invloed van polyamines in de melk op de darmpermeabiliteit voor proteïnen bij al dan niet prematuur geboren kinderen.
6. Analyse van de ontogenese van het immunitair mucosaal systeem bij de niet gespeende rat die al dan niet polyamines inneemt.
7. Gevolgen van het innemen van verontreinigende voedingsmiddelen door de zogende wijfjesrat voor de kenmerkende parameters van de darm en de lever van de ratjes.
8. Analyse van het werkingsmechanisme van de spermine.
9. Epidemiologische studie.
10. Curatieve werking van de inname van polyamines tegenover de intensiteit van de reacties van patiënten met voedselallergieën.

De doelstellingen 9 en 10 werden toegevoegd tijdens de uitvoering van het onderzoeksproject.

De volgende voornaamste resultaten en conclusies werden bereikt:

De inname van putrescine wijzigt de maturatiegraad van de darm bij de rat niet. De orale toediening van spermine veroorzaakt wel een dergelijke wijziging bij dit dier. Dit resultaat werd bevestigd door twee laboratoria die onafhankelijk van het onze werken. De toevoeging van spermine aan de voeding van niet gespeende ratten regelt de permeabiliteit van de darm voor macromoleculen. Deze vaststelling werd bevestigd door een ander laboratorium. De inname van spermine leidt tot maturatie van de lever en de pancreas en tot een wijziging van immuniteitseigenschappen. Deze resultaten bevestigen de hypothese dat spermine in de voeding een preventieve rol zou kunnen spelen om voedselallergieën te voorkomen.

Deze laatste hypothese wordt nu gecontroleerd.

De concentratie van polyamines in de moedermelk werd bij 60 vrouwen gemeten tussen de eerste lactatieweek en de zesde maand van de lactatieperiode. De concentratie van polyamines in 18 soorten babymelkpoeders werd eveneens bepaald. Het spermine- en spermidinegehalte van deze poeders liggen duidelijk lager dan bij de menselijke melk. Deze conclusies werden bevestigd door vier buitenlandse laboratoria. Aangezien bewezen werd dat allergieën vaker voorkomen bij baby's die melkpoeder kregen dan bij andere baby's, bevestigen deze resultaten de hypothese dat spermine en spermidine een beschermende invloed hebben tegen die aandoeningen.

Wij hebben de darmpermeabiliteit voor a-lactalbumine onderzocht bij baby's die melk kregen die respectievelijk rijk en arm was aan polyamines. De bekomen resultaten bevestigen dat de permeabiliteit voor macromoleculen van de baby's die moedermelk kregen, niet dezelfde als deze van baby's die kunstmatige melk kregen. Ze suggereren eveneens dat deze permeabiliteit beïnvloed wordt door het toevoegen van spermine en spermidine aan de poedermelk.

Een epidemiologische studie werd georganiseerd. Wij hebben deze studie slechts op kleine schaal kunnen uitvoeren. Op basis van de bekomen resultaten kunnen we dus geen uitdrukkelijke conclusies formuleren. Een (niet significante) tendens bevestigt echter dat kinderen die melkpoeder kregen vaker allergisch zijn dan andere kinderen en dat kinderen die moedermelk kregen die veel polyamines bevat, minder vaak allergisch zijn dan kinderen die moedermelk kregen die weinig polyamines bevat.

Wij hebben het effect onderzocht van spermine en van spermidine op de differentiëring en de proliferatie van lymfocyten (geïsoleerd uit amandelen die om therapeutische redenen verwijderd werden bij jonge kinderen) die in vitro gekweekt werden, al dan niet in aanwezigheid van een voedingsallergeen. De vaststellingen bij deze studie bevestigen dat spermine de proliferatie en de differentiëring van geïsoleerde en in aanwezigheid van L-fytohemagglutinine gekweekte T-lymfocyten stimuleert.

Bij de rat werd het werkingsmechanisme van de spermine ter hoogte van de darm, van de lever en van de pancreas in talrijke studies onderzocht. Deze stof werkt op de enterocyten, rechtstreeks of onrechtstreeks, en op de lever- en de pancreascellen (activering van de secretie van ACTH, van corticosteron en van cytokines). In experimentele omstandigheden veroorzaakte de aan de ratjes toegediende spermine geen kankerverwekkende letsels.

Om de curatieve werking van de inname van polyamines te kunnen bestuderen tegenover de intensiteit van de reacties van patiënten met voedselallergieën, hebben wij de darmpermeabiliteit voor macromoleculen gemeten bij kinderen die leden aan verschillende darmziekten. Hiertoe werden gastro-resistente "pellets" (granulaten) gemaakt die humane a-lactalbumine bevatten. De preliminaire resultaten tonen aan dat de techniek voor de meting van de darmpermeabiliteit voor macromoleculen die uitgewerkt werd voor het gebruik van deze pellets, het bestaan van een voedselallergie bij het kind kan bevestigen, en geschikt is om de toegepaste behandeling te volgen.

Al deze resultaten en ook andere hier niet vermelde resultaten bevestigen dat de spermine en de spermidine zeer waarschijnlijk preventieve agentia zijn voor voedselallergieën. Vóór we echter voorstellen om deze stoffen bij de poedermelk voor baby's te voegen of de concentratie van deze stoffen in de moedermelk te verhogen, moeten onze conclusies worden bevestigd in een internationale studie waarbij een voldoende groot aantal onafhankelijke laboratoria betrokken worden.

D. Voedselsconsumptie

D1. Een actiegericht food monitoring programma

Prof. H. Deelstra, UIA, Fac. Geneeskunde & Farmacie, Lab. voor Bromatologie, 
Universiteitsplein 1, 2610 Wilrijk

Prof. D.L. Massart, VUB, Fac. Geneesk., Dienst Farmaceutische en Biomedische analyse,
Laarbeeklaan 103 - 1090 Brussel

Prof. C. Van Peteghem, RUG - Fac. Farmacie, Lab. voor Bromatologie, Harelbekestraat 72 - 9000 Gent

De doelstellingen van dit project waren tweeledig. In de eerste plaats werd de concentratie van bepaalde bestanddelen in de voeding en de levensmiddelen in België bepaald: enerzijds anorganische bestanddelen, d.w.z. 14 mineralen en spoorelementen, anderzijds organische bestanddelen, nl. het totale vetgehalte en het vetzurenprofiel. Om betrouwbare resultaten te bekomen was het absoluut noodzakelijk een grondig kwaliteitsborgingsplan te ontwikkelen. In de tweede plaats werden wiskundige en statistische technieken ontworpen die tot doel hadden relevante conclusies te trekken uit het groot aantal bekomen resultaten. Deze mathematische technieken laten bovendien toe om aan de hand van bestaande gegevens omtrent kankerincidenties in België en andere Europese landen een relatie te leggen tussen de geconsumeerde levensmiddelen, de onderzochte bestanddelen in deze levensmiddelen alsook de geschatte dagelijkse inname hiervan.

De verschillende parameters van het kwaliteitsborgingsplan werden met veel aandacht onderzocht. Een validatiestrategie werd ontwikkeld op basis van welomschreven en goed gespecifieerde performantieparameters. Voor de validatie van de verschillende atoom absorptie spectrometrische methoden werd een gebruiksvriendelijk computersysteem ontworpen. De gebruikte analysemethoden werden grondig geëvalueerd alvorens over te gaan tot de specifieke analyses.

Voor wat betreft de analyse van de voedselbestanddelen en de interpretatie van de resultaten werden drie groepen van staalnames uitgevoerd. Voor het schatten van de dagelijkse inname in België van de specifieke voedselbestanddelen werd gekozen voor het gebruik van duplicaten van 24-uurs menu's, en dit omwille van het feit dat er in België geen recente consumptiegegevens voorhanden zijn. Op vijf verschillende plaatsen werden op zeven opeenvolgende dagen 24-uurs menu's verzameld. Voor de studie van het totale vetgehalte alsmede van het vetzuurprofiel werd een apart bemonsteringsplan uitgewerkt op basis van de BIRNH-studie (Belgian Interuniversity Research on Nutrition and Health). Individuele levensmiddelen die verantwoordelijk zijn voor minstens 90% van de dagelijkse vetinname, nl. in totaal een 150-tal, werden onderzocht. 

Omdat mineralen en spoorelementen in bijna alle levensmiddelen aanwezig zijn werden deze laatste gegroepeerd in 16 verschillende categorieën. Uit deze categorieën werden een 300-tal individuele levensmiddelen gekozen voor de analyse van mineralen en spoorelementen.

De resultaten van de analysen van mineralen en spoorelementen werden besproken zowel voor de 24-uurs menu's als voor de individuele levensmiddelen. Wanneer men de dagelijkse opname vergelijkt met internationale en Belgische normen dan wordt vastgesteld dat er zich geen toxicologische problemen voordoen voor wat betreft de vijf niet-essentiële elementen: cadmium, lood, arseen, aluminium en chroom. Voor de essentiële mineralen en spoorelementen bestaan er geen problemen voor de inname van koper, mangaan en zelfs voor kalium en natrium. Wel is er duidelijk een ernstig probleem vanwege de te lage inname van calcium en vanwege een te lage ijzerinname voor vrouwen. De inname van magnesium, zink en seleen is marginaal te noemen. Een interne vergelijking van de inname van deze anorganische bestanddelen op de vier verschillende reeksen van 24-uurs menu's toont aan dat er duidelijk merkbare verschillen bestaan die afhankelijk zijn van de keuze van levensmiddelen alsmede eventueel de bereidingswijze. Een vergelijkende studie van de in dit project vastgestelde inname met deze berekend uit levensmiddelentabellen uit verschillende landen toont aan dat dit met de grootste voorzichtigheid moet gebeuren.

Het vetgehalte alsook het vetzuurprofiel werd bepaald in de 150 gekozen individuele levensmiddelen, die volgens de BIRNH-studie verantwoordelijk zijn voor 90% van de vetaanvoer alsook in de bemonsterde 24-uurs menu's. De resultaten tonen aan dat de totale vetopname in België zeer hoog is nl. 42% van de totale energieopname. De belangrijkste groepen van levensmiddelen hiervoor verantwoordelijk, zijn "vetten, oliën en sauzen" (50%), "vlees en gevogelte" (22%) en "kaas en eieren" (9%). Uit een studie van het aandeel van de verschillende groepen vetzuren in de totale vetinname volgt dat de verzadigde-, de mono- en de poly-onverzadigde vetzuren resp. 17%, 14% en 8% van de totale energieinname uitmaken. Wanneer men de innames van vetzuurgroepen vergelijkt in de verschillende provincies dan stelt men vast dat er niet alleen verschillen bestaan tussen Vlaanderen en Wallonië, maar ook tussen de provincies onderling.

De gemiddelde vetzuurinnames voor de vier locaties waar 24-uurs duplicaatvoedingen werden verzameld volgen eenzelfde trend als deze berekend aan de hand van de BIRNH-studie. Een vergelijking met internationale normen toont aan dat de relatieve totale vetinname in België veel te hoog ligt in vergelijking met de aanbevolen 15-30% waarde.

Voor verzadigd vet geldt dit eveneens, nl. 16.6% in plaats van 10%. De opname van polyonverzadigde vetzuren daarentegen is relatief hoog nl. 7.6% in plaats van 3-7%. Een vergelijking met recente EU-aanbevelingen toont aan dat voor de n-6 vetzuren er geen problemen van deficiëntie bestaan: 90% van de bevolking heeft een inname die hoger ligt dan de PRI-waarde. De inname van de n-3 vetzuren is echter relatief laag. Gemiddeld 37% van de bevolking heeft een inname lager dan de PRI.

Voor de relatie van de opname van de bestudeerde bestanddelen met voeding en de incidenties van de verschillende soorten kanker werden twee uitvoerige literatuurstudies uitgevoerd resp. over vet en vetzuren en over de mineralen en spoorelementen. Uit deze literatuurstudies kan besloten worden dat een hoge vetinname duidelijk gecorreleerd is met kanker van borst, colon en prostaat. Verder blijkt dat te hoge gehalten aan n-6 vetzuren positief correleren met verschillende kankers terwijl n-3 vetzuren eerder een beschermend effect hebben. Voor de mineralen en spoorelementen volgt uit de literatuurstudie dat een verhoogde inname aan calcium, zink en seleen beschermend zou zijn voor het voorkomen van kankers, terwijl een te hoog natriumgehalte indirect aanleiding kan geven tot maagkankers. Wanneer deze literatuurgegevens vergeleken worden met de in deze studie bekomen resultaten omtrent de opname van vet, vetzuren, mineralen en spoorelementen dan volgt dat er in België duidelijk een te hoge vetopname is, een hoge inname van de n-6 vetzuren en een te lage inname voor de n-3 vetzuren. Voor de mineralen en spoorelementen kan men stellen dat er te weinig calcium, zink en seleen opgenomen wordt.

Dankzij het gebruik van multivariate technieken werd getracht specifieke kankertypes te correleren met voedingsgewoonten. Men kan hier niet ingaan op alle resultaten, maar slechts voorbeelden geven. Zo blijkt uit de Europese gegevens dat België koploper is voor een aantal kankertypes (colon, borst, ...). Bovendien is de Belgische voeding gekenmerkt door een hoge inname van dierlijke vetten en een lage inname van groenten en granen. Ook de interne Belgische gegevens zijn leerzaam. Zij geven aan dat er duidelijk andere kankerpatronen bestaan in de verschillende delen van het land en dat die verschillen zich niet tot de noord/zuid-as beperken. Zo blijkt uit de Belgische gegevens dat de hoogste kankermortaliteit voor colon- en rectumkanker in Oost- en West-Vlaanderen optreedt, waar het vleesverbruik hoog is en het groentenverbruik laag, terwijl strottenhoofd/slokdarmkanker het meest optreedt in Henegouwen waar de consumptie van alcoholische dranken het hoogst is.

De correlaties van de eigen analyseresultaten met kankerincidenties in België worden vooral bemoeilijkt doordat de consumptiegegevens dateren uit de jaren '80-'85 (BIRNH-studie), terwijl de meest recente mortaliteitsgegevens dateren van 1989. De tijd tussen de inductie door de voeding en de uiteindelijke ontwikkeling van kanker wordt statistisch geschat op ongeveer 10 jaar.

De aanbevelingen die uit dit onderzoeksproject volgen richten zich tot alle actoren die op de verschillende niveaus een verantwoordelijkheid hebben inzake een optimaal voedings- en gezondheidsbeleid. Naast de studie van de aanwezigheid van de hier bestudeerde levensmiddelenbestanddelen zijn er nog tal van andere voedselcomponenten te bestuderen die verband houden met het ontstaan of het voorkomen van kanker. Continu geactualiseerde gegevens in verband met morbiditeit en mortaliteit zijn noodzakelijk. Op technisch vlak moeten uitsluitend gevalideerde technieken gebruikt worden voor de aanvulling van levensmiddelentabellen. Het gebruik van multivariate technieken moet gestimuleerd worden. Regelmatige voedselconsumptiepeilingen voor de gehele Belgische bevolking zijn noodzakelijk. Sensibiliseringscampagnes zijn nodig om het voedingsgedrag te verbeteren ter voorkoming van ziektes. De voedselproducerende instanties moeten duidelijk rekening houden met het steeds betere inzicht inzake de relatie voeding-ziekten.
Zowel naar de consument als naar de jeugd toe moet een actief voorlichtingsbeleid gevoerd worden, met name in verband met het leren lezen en begrijpen van de voedseletikettering.

D. Voedselsconsumptie

D2. Belgian Extension on Nutrition Education and Data Input, Control, Training, Exchange (BENEDICTE)

Dr. Van Havere, Ministerie Volksgezondheid, Eetwareninspectie, Rijksadministratief Centrum,
Pachecolaan 19 / bus 5, 1010 BRUSSEL

De doelstellingen van dit onderzoeksproject "Belgian Extension on Nutrition Education and Data Input, Control, Training, Exchange" van het Impulsprogramma "Gezondheidsrisico's i.v.m. voeding" zijn de volgende:
- uitbreiding van de voedingsmiddelentabel met kwaliteit-cijfermateriaal verkregen door analyses voor tot op heden ontbrekende nutritionele gegevens.
- uitbreiding van de informatica omgeving (soft- en hardware) (ook geldig voor de andere Europese landen) nodig voor de toekomstige uitbating van de voedingsmiddelentabel
- ontwikkeling van op maat ontworpen software programma's en pakketten en/of drukwerk voor de potentiële gebruikers
- training-sessies organiseren voor een efficiënt gebruik van de ontworpen programma's.

Dit project laat toe te besluiten dat verdere samenwerking gewenst is tussen overheid, onderzoekswereld en bedrijfsleven (voedingsindustrie en distributie) teneinde de databank inzake voedingsstoffen in voedingsmiddelen op een wetenschappelijke wijze verder uit te bouwen.

Dit project betekende een ware stimulans om de bekomen gegevens op een gestruktureerde en wetenschappelijke wijze te verzamelen en te verwerken.

De wettelijke regeling inzake voedingswaarde - aanduiding van voorverpakte voedingsmiddelen (KB van 8 januari 1992) vormt een belangrijke referentie.

Binnen deze wettelijke context kan het bedrijfsleven een belangrijke bijdrage leveren door eigen gevalideerde gegevens ook ter beschikking te stellen voor opname in de NUBEL-tabel.

De door de erkende laboratoria gereperduceerde analyse-gegevens welke door de Wetenschappelijke Raad werd gevalideerd moeten dus ook beschikbaar en herkenbaar zijn door het bedrijfsleven.

Vergeten we immers niet dat het uiteindelijk de verbruiker is voor wie deze gegevens bestemd zijn. Door middel van het etiket zal hij zich over de samenstelling van zijn voeding kunnen informeren.

Het project liet NUBEL toe d.m.v. de bekomen analyse-resultaten, objectieve en wetenschappelijk relevante informatie te verschaffen aan:
- potentiële gebruikers, in casu de voedingsindustrie en distributie, die vragende partijen waren om bepaalde gegevens te bezorgen;
- het onderwijs, met als doel, voorlichting en gezondheidsopvoeding tot gezonde voeding te geven.

Het is dus duidelijk dat een goed gestoffeerde databank inzake voedingsstoffen een belangrijk instrument is voor een samenhangend voedingsbeleid.

De Nationale Raad voor de Voeding in België heeft juist zijn aanbevelingen inzake voedingsstoffen klaar. Het Benedicte-project van het impulsprogramma "gezondheidsrisico's i.v.m. voeding" sluit hier perfect op aan: inzicht brengen inzake de samenstelling van voedingsmiddelen om een optimale keuze toe te laten inzake een evenwichtige en gezonde voeding.

Een goed gestruktureerde samenwerking tussen de verschillende beleidsverantwoordelijken is hierbij een must.

Wil men in België komen tot een echt voedingsbeleid dan zullen op gewestelijk en federaal vlak de verantwoordelijke diensten moeten samenwerken. Dank zij de merkelijke inspanningen bij NUBEL, wordt de voedingsmiddelentabel en zijn toepassingsprogramma "Voedingsplanner" naar waarde geschat bij de Gewestelijke instanties. De samenwerking is dus zeker goed te noemen. Ook NUBEL, hoewel een nationale instantie, is actief bij Gewestelijke diensten.

Dankzij het FLAIR-project "Eurofoods-Enfant" heeft België zich op Europees vlak een grote achterstand weten in te halen. Bovendien lag het Benedicte-project mede aan de basis van dit succes. Een beheerssysteem "NIMS", dat op Europees vlak navolging kende via EURONIMS was mogelijk door dit project.

Door de vruchtbare wisseling tussen beide projecten, heeft België met name NUBEL, veel geleerd en minder leergeld moeten betalen. Toch mogen we niet in een zelfgenoegzaamheid vervallen: er is immers nog een lange weg te gaan.

Wij zouden dan ook ten zeerste aanbevelen dat België deze Europese schakel niet mist voor de toekomst.

NUBEL zal ook voor de toekomst trachten deze internationale aansluiting te behouden.

Als besluit mogen we stellen dat NUBEL, dank zij dit project, de unieke kans te baat genomen heeft om een werkelijke doorbraak te kennen.

Het beheerssysteem "NIMS", maar ook de analyse-gegevens in de databank werden in belangrijke mate gerealiseerd dank zij dit project.

Daarenboven betekende de publicatie van de voedingsmiddelentabel een belangrijke doorbraak en erkenning in de voedingswereld.