Onderzoeksproject P7/44 (Onderzoeksactie P7)
Eiwitten zijn de hoofdproducten van de genetische informatie en zijn de essentiële biologische macromoleculen die de structuur en functie van alle levende celsystemen bepalen. Eiwitten sturen de ontwikkeling van organismen, het metabolisme en de responsen op omgevingsstimuli. Ze interageren met liganden met diverse grootte dewelke substraten, inhibitoren, effectoren, nucleïnezuren, lipide dubbellagen of andere eiwitten kunnen zijn. Ongewenste wijzingen van deze interacties kunnen een normaal cellullair proces omzetten naar een aberrante vorm, met verschillende types van pathologieën als gevolg. Alternatief kan het ontwikkelen van kleine moleculen die kunnen interfereren met cruciale eiwitfuncties in de levende cellen een belangrijke bijdrage leveren aan menselijke therapie en antimicrobiële chemotherapie, die gebaseerd zijn op het verstoren van metabole processen.
In dit post-genomische tijdperk, hebben we toegang tot een zeer grote hoeveelheid genomische informatie over een steeds groeiend aantal organismen. In schril contrast hiermee stellen we vast dat we nog steeds niet in staat zijn om deze data te integreren to een gedetailleerd beeld van het functioneren van levende cellen. Deze paradox kan verklaard worden door het feit dat het bepalen van de genoomsequenties veel sneller vooruitgaat dan onze kennis van de verwantschap tussen structuur en functie van en de interacties tussen macromoleculen. Traditioneel werden eiwitten als individuele entiteiten bestudeerd. In het post-genomische tijdperk ontwikkelt zich stilaan een nieuw soort eiwitonderzoek dat zich nog steeds toespitst op de atomaire en moleculaire aspecten maar waar men zich nu tot doel stelt om een meer geïntegreerd beeld te krijgen van de eiwitfunctie in de context van levende organismen. De moderne eiwitstudies richten zich dan ook op alle niveaus van de organisatie van het leven: van de kleine eiwitmoleculen tot grote eiwitcomplexen die de interacties tussen eiwitten met eiwitten bevorderen, maar ook die met kleine liganden en nucleïnezuren tot en met de dynamische netwerken in cellen en modelorganismen. Het is om deze reden dat een geïntegreerd project rond de wetenschap van eiwitten een grote uitdaging vormt en een sterk interdisciplinair onderzoeksveld opent dat gaat van biofysica over de chemie tot aan de celbiologie.
Het doel van het iPROS project is om de integratieve eiwitwetenschappen te promoten en te versterken om een beter beeld te krijgen van de structuur en functie van eiwitten. Wij richten ons mede op de opleiding van jonge onderzoekers zodat zij zich kunnen opwerken tot vooraanstaande eiwitonderzoekers. Specifiek willen wij ons richten op 4 hoofdonderzoekslijnen: (i) eiwitopvouwing, (ii) eiwitengineering en eiwit-ligand interacties, (iii) targets in het kader van antibacteriële resistentie en (iv) eiwit supramoleculaire assemblage en cellulair metabolisme. Elk van deze thematieken vormt een werkpakket. Om op de meest efficiënte manier bij te dragen aan deze onderzoekslijnen werd een samenwerking opgezet tussen Belgische groepen die vooraan staan in het domein van de eiwitwetenschappen en complementaire disciplines. Deze groepen zullen hun beschikbare technologieën in het domein van de moleculaire biologie, structurele en cellulaire biologie, bacteriologie, biofysica, bioinformatica, eiwit- en membraanchemie, enzymologie en medicinale en theoretische chemie ter beschikking stellen. De bijdrage van de buitenlandse partners is precieus in het domein van de biofysica, structurele biologie, bacterieel celwandmetabolisme en prokaryote cellulaire regulatie en ontwikkeling. De IUAP partners gebruiken verschillende maar vooral complementaire benaderingen in hun eiwitstudies. Daarom beoogt dit netwerk een kruisbestuiving in het gebied van de studies van eiwitinteractie, waarvan alle partners kunnen profiteren. Op deze manier wordt een uniek en generisch instrument gecreëerd voor de studie van eiwitinteracties in België. Op kruissnelheid zullen studenten, onderzoeksgroepen (en bedrijven) in Belgie hun voordeel kunnen halen uit deze unieke expertise in het veld van de eiwitinteracties en –opvouwing.
Beschrijving van de werkpakketten
Werkpakket 1. Eiwitopvouwing (Partners: P1, P3, P6 and INT1)
Een goed begrip van de basisaspecten van eiwitopvouwing is cruciaal om verschillende biologische processen te beschrijven, gaande van de transcriptie to moleculaire motors en ziekten die geassocieerd zijn met verkeerd opgevouwen eiwitten. Klassieke in vitro studies van modeleiwitten, waaronder enzymen van extremofielen zullen verdergezet worden met snelle mengmethodieken gecombineerd met optische spectroscopische methoden en NMR om een volledig beeld te krijgen van het opvouwingsproces. We zullen onderzoek doen naar de onderlinge mechanismen van verkeerde opvouwing van eiwitten en amyloide fibervorming zoals die voorkomen in neurodegeneratieve en systemische amyloidose, waarbij we gebruik maken van verschillende eiwitmodellen. Transgene Caenorhabidits elegans stammen die geselecteerde eiwitten expresseren zullen worden aangemaakt om de fibrilvorming en toxiciteit in vivo bestuderen.
We zullen ook analyseren hoe levende organismen voordeel halen uit de inherente neiging van eiwitten om dergelijke vezelstructuren aan te maken. Een goed gedocumenteerd voorbeeld van functioneel amyloid is het curlin, waarvan de fibrillen door Escherichia coli en Salmonella gebruikt worden om biofilm te maken en om niet-biologische oppervlakken te koloniseren. We zullen onderzoeken hoe de amyloide subeenheden getransporteerd en geassembleerd worden op het buitenste membraanoppervlak zonder cytotoxische effecten. We zullen verder nog onderzoek uitvoeren op de oxidatieve eiwitopvouwing in het periplasma van Caulobacter crescenus, een goed model om de celcyclus en cellulaire differentiatie te bestuderen.
Werkpakket 2. Eiwitengineering en proteine-ligand interacties (Partners: P1, P2, P3, P4)
WP2 zal biologische, structurele, chemische en combinatoriële benaderingen gebruiken om eiwitfunctie en moleculaire interacties te exploreren. Het eerste specifieke doel van WP2 is gericht op het verbeteren van bestaande eiwitten en enzymen om nieuwe eigenschappen te creëren, zoals affiniteit voor een ligand, duurzame effecten en/of een grotere selectiviteit. Daarnaast zullen we hybride-eiwitten ontwikkelen die kunnen interageren met verschillende polysacchariden of allosterische regulatie vertonen. Het tweede aandachtspunt van WP2 is gericht op de eiwit-ligandinteracties zoals metaalion-eiwitinteracties en lipide-eiwit interacties. We gaan ons toespitsen op zink/cadmium transporters van de Arabidopsis halleri P-type ATPase familie. Vergeleken met de prokaryote homologen hebben plantaardige metaaltransporters bijkomende cytoplasmatische domeinen verkregen die betrokken kunnen zijn bij metaalbinding of –sensing en/of de regulatie van de eiwitactiviteit. We stellen ons tot doel om de metaal-bindingsaffiniteit te bepalen, net als de potentiële structuurveranderingen die optreden bij metaalbinding. Ten slotte zullen we ook de signaaltransductiemechanismen die geïnitieerd worden door de aanwezigheid van peniciline in cultuurmedia ophelderen door de interactie tussen lipiden en het transmembranaire domein van BlaR te bestuderen.
Werkpakket 3: Eiwittargets tegen bacteriële resistentie (Partners: P1, P2, P3, P5, P6 and INT2)
WP3 heeft als doel om eiwitten te bestuderen die geïdentificeeerd werden als doelwitten om bacteriële resistentie tegen geneesmiddelen te omzeilen, waarbij we ook nieuw chemische strategieën uitbouwen samen met “lead compound” benaderingen. Het eerste deel beoogt eiwitten die betrokken zijn bij peptidoglycaanbiosynthese. Het C55-PP fosfatase katalyzeert de defosforylatie van C55-PP, wat leidt tot de actieve vorm van de lipide drager die vereist is voor de translocatie van de glycaaneenheden doorheen de cytoplasmatische membraan. Polymerizatie van peptidoglycaan macromoleculen vereist verder klasse A penicillinebindende eiwitten (PBPs) via hun transglycolase (Tgase) en transpeptidase (Tpase) activiteit. Een belangrijk probleem inzake bacteriële reistentie tegen beta-lactam antibiotica betreft het verschijnen van gewijzigde doelwitten (resistente PBPs of rPBPs) en de synthese van -lactam degraderende enzymen (-lactamases) . In het kader van het IAP 6/19 project werd een zeer grote inspanning geleverd voor de synthese van nieuwe antibiotica gericht tegen Tgases, rPBPs en -lactamases waarbij verschillende lead componenten nu in de pijplijn zitten. Verder zullen ook nieuwe benaderingen gevolgd worden waaronder de synthese van nieuwe moleculaire scaffolds, het screenen van peptidebibliotheken en fragment gebaseerde screening met X-stralenkristallografie.
Werkpakket 4. Supramoleculaire assemblages van eiwitten en cellulair metabolisme (Partners : P1, P2, P4, P6, INT2 and INT3)
Eiwitten werken niet als geïsoleerde entiteiten. In een cellulaire context worden ze sterk beïnvloed door permanente en transiënte interacties met andere biomoleculen. Hun expressie en activiteiten worden sterk geregeld door hun connectie in eiwitnetwerken. Daarom wordt WP4 toegespitst op het inwinnen van inzichten in de assemblage en het werkingsmechanisme van eiwitmachines en signaalnetwerken die de cellulaire toestand bepalen. De belangrijkste topics van WP4 zijn (1) de analyse van de interacties en de structurele veranderingen van de belangrijkste eiwitten van het E.coli divisoom met het oog op het verkrijgen van een dynamisch beeld van dit multi-eiwitcomplex en de interacties die nodig zijn voor de celdeling en (2) Het begrijpen van de signalisatie en moleculaire mechanismen die resulteren in de aanpassing van organismen tegenover omgevingstress en aanleiding geeft tot resistentie, adaptatie of transities naar verschillende cellullaire toestanden (biofilm, sporulatie, antibioticaproductie).
Werkpakket 5. Netwerking en disseminatie (alle partners)
De coördinator zal verantwoordelijk zijn voor de algemene organisatie van het netwerk. Om hem hierbij te helpen wordt een algemeen wetenschappelijk stuurcomité opgestart, bestaande uit de WP-verantwoordelijken en een senior wetenschapper van de overige partners. Het stuurcomité zal regelmatig bijeenkomen. De WP-leiders zullen hun eigen werkpakket coördineren en veranwoordelijk zijn voor de uitvoering van de wetenschappelijke experimenten. Een Subcommissie zal waken over de verspreiding van de resultaten naar de website, nieuwsbrieven, seminaries en internationale meetings.
Werkpakket 6. Training (alle partners)
Bijzondere aandacht zal besteed worden aan de opleiding van PhD studenten en andere onderzoekers die zich in een vroeg stadium van hun loopbaan bevinden. Een trainingsprogramma wordt opgezet met het oog op het verbeteren van de loopbaanperspectieven door hun wetenschappelijke vaardigheden te verbreden. Het programma heeft ook als doel om meer ervaren onderzoekers te ondersteunen in het verwerven van complementaire en nieuwe vaardigheden en competenties. Naast de lezingen die reeds in de verschillende doctorale scholen gegeven worden zal het IUAP consortium haar eigen activiteiten organizeren onder de vorm van workshops, themaweken en seminaries.
