| Description nl | Het bloedcirculatie systeem is het eerste orgaansysteem dat functioneel wordt gedurende de ontwikkeling en is vereist voor de overleving van het embryo. Het is daarom noodzakelijk dat de bloedvaten meegroeien met het embryo om zo alle weefsels en organen efficiënt te doorbloeden. In de dooierzak van het muis embryo bestaat het initiële bloedvaten systeem uit een willekeurig georganiseerd netwerk van capillairen dat lijkt op een honinggraad structuur. Als het hart begint te kloppen en rode bloedcellen in de vaten circuleren, dan wordt het netwerk gereorganiseerd in een hiërarchische structuur van aderen, slagaderen en capillairen. Dit proces van vasculaire reorganisatie omvat het uitgroeien van nieuwe vaten in ruimten zonder bloedvaten, longitudinale splitsing van bloedvaten, actieve regressie van capillaire segmenten, fusie van kleine vaten tot grotere vaten, uitgroei van kleine vaten en het aantrekken van vaatwand ondersteunende cellen. Het stromen van rode bloedcellen in de circulatie is een stimulus voor het induceren van vasculaire reorganisatie. De bloedstroom creëert wrijving, ook wel schuifspanning genoemd, tegen de endotheelcellen die de bloedvaten bekleden. Het niveau van schuifspanning is voornamelijk afhankelijk van de diameter van de vaten (een toegenomen diameter vermindert de schuifspanning), maar ook de bloedstroomsnelheid en de viscositeit (toegenomen bloedstroomsnelheid of viscositeit verhogen de schuifspanning). Als het niveau van schuifspanning verandert, dan vindt er reorganisatie van de bloedvaten plaats. Het is ook bekend dat schuifspanning de drijfkracht is voor reorganisatie van bloedvaten. Endotheelcellen worden sterk beïnvloed door schuifspanning en hierdoor worden vele verschillende signaalwegen geactiveerd. Mechanosensitieve structuren bevinden zich op alle oppervlakten van endotheelcellen en omvatten ionenkanalen, de glycocalyx, primaire cilia, caveolae, integrines en het junctioneel mechanosensationeel complex van VEGF2, PECAM en VE-CADHERIN. Stimulatie van endotheelcellen door bloedstroom activeert een verscheidenheid van signaalwegen, zoals NOTCH, PIEZO1, WNT/β-catenin en BMP, en arteriële en veneuze makers. Verstoring van de BMP-signalering is geassocieerd met een genetische aanleg voor de ontwikkeling genoemd arterioveneuze malformaties (AVM). AVM worden gedefinieerd als een directe verbinding tussen een arterie en een vene, waardoor de capillairen overbrugd worden. In de ziekte van Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HTT) zijn specifiek mutaties in ALK1, Endoglin, BMP9 en SMAD4 genen geassocieerd met AVM-formatie. Al deze componenten spelen ook een rol in schuifspanning geïnduceerde signalering. BMP9 bindt aan de ALK1 receptor en zijn co-receptor Endoglin en fosforyleert vervolgens SMAD1/5/9. SMAD1/5/9 vormt een complex met SMAD4 en verplaatst zich naar de nucleus om daar de signalering verder te induceren. Schuifspanning versterkt dit signaal wat leidt de gevoeligheid van endotheelcellen voor picomolaire niveaus van BMP9. ALK1 is een receptor voor liganden van de TGFβ superfamilie en andere receptoren in deze familie activeren niet-kanonische signaleringpaden, zoals MAPK, JNK, p38, Ras, ERK, NFκB en mTOR, onafhankelijk van SMAD activatie. Echter de participatie van ALK1 in niet-kanonische signalering in endotheelcellen is nooit getest.In vitro en in vivo modellen van verstoorde BMP9/ALK1/Endoglin/SMAD1/4/5 mechanotransductie tonen dat deze signaalweg cruciaal is voor de regulatie van endotheelcel vorm en gedrag. Een gebrek aan deze signalering leidt in overmatig endotheelcel spreiding onder bloedstroom en proliferatie. Normaliter migreren endotheelcellen opwaarts tegen de richting van de bloedstroom. Echter in het geval van verstoorde BMP9/ALK1/ENDOGLIN/SMAD1/4/5 mechanosensitive signalering vindt er zowel in vitro als in vivo neerwaartse migratie van endotheelcellen in de richting van de bloedstroom plaats. Er wordt verondersteld dat de resulterende endotheelcellen in de post-capillaire venules en hun ongepaste expansie en proliferatie onder bloedstroom bijdragen aan de pathofysiologie van AVM. In deze thesis hebben wij eerst geïndificeerd dat Connexin37 (Cx37) specifiek en verschillend gereguleerd wordt door een combinatie van schuifspanning en BMP9 signalering. Connexins zijn transmembraan proteïnen die in groepen van zes functioneren als transmembrane kanalen (connexons). Connexons van naburige cellen kunnen koppelen, waardoor een gap junctie gevormd wordt. Deze junctie bevordert de uitwisseling van kleine moleculen tussen de cellen. Bovendien kunnen de C-termini van de connexins aan verscheidende intracellulaire proteins binden en daardoor andere signaalwegen moduleren. Wij hebben gevonden dat Cx37 expressie toeneemt onder statische condities, maar onder verschillende schuifspanning condities afneemt. Zowel de toename als afname in Cx37 expressie was afhankelijk van SMAD1/5 signalering. Dit suggereert dat schuifspanning ook SMAD1/5 onafhankelijke signaleringpadden activeert die de Cx37 expressie moduleren. Andere onderzoekers hebben echter getoond dat schuifspanning de expressie van Cx37 verhoogd indien er serum is toegevoegd in het medium dat gebruikt wordt voor de schuifspanning experimenten. Wij hebben BMP10 geïdentificeerd als een component in het serum die verantwoordelijk is voor het veranderen van het expressie patroon van Cx37 onder bloedstroom. Dit impliceert dat BMP10 Cx37 sterk kan activeren door SMAD1/5 onafhankelijke mechanismen. In vivo hebben wij gevonden dat muizen embryo’s met een volledig endotheelcel specifieke deletie van SMAD1/5 spontaan AVM vormen. Echter in muizen met een heterozygote deletie van SMAD1/5 in endotheelcellen is er een aanleg voor TNFα-geïnduceerde AVM-formatie. TNFα reduceert Cx37 expressie in vitro. Wij hebben gevonden dat gedurende de normale ontwikkeling van bloedvaten Cx37 initieel geëxpresseerd is in de gehele capillaire plexus, maar de expressie later vermindert in de groeiende arteriën en venen voordat er een volgroeid arterieel-specifiek expressie patroon wordt gevormd. TNFα behandeling leidde tot additionele Cxc37 negatieve regio’s van capillairen die correleerden met de regio’s van AVM-formaties. Mechanistisch hebben wij aangetoond dat het verlies van Cx37 resulteert in neerwaartse migratie van endotheelcellen in de richting van de bloedstroom. Wij stellen daarom voor dat Cx37 de uitwaartse reorganisatie van vaten in reactie op bloedstroom weerhoudt. Verlies van Cx37 vormt een noodzakelijke en permissieve stimulus voor de ontwikkeling van AVM in bloedvaten die al aanleg hebben voor de ontwikkeling van AVM, doordat zij ongepaste mechanotransductie (onder andere verstoringen in het SMAD1/5/9 signalering) hebben.
|
|---|
| Description en | The circulatory system is the first organ system to become functional during embryonic development and is required for survival of the embryo. As such, the vasculature must grow with the embryo, be efficient, and perfuse all tissues and organs. In the mouse embryonic yolk sac, the initial vasculature consists of a randomly organized, honeycomb-like network of capillaries. As the heart begins to beat and red blood cells enter circulation, this network remodels into a hierarchical structure of arteries, capillaries, and veins. This process of vascular remodelling involves sprouting of new vessels into avascular spaces, longitudinal splitting of blood vessels, active regression of capillary segments, fusion of smaller vessels into larger vessels, outward growth of smaller vessels, and recruitment of mural support cells. The entry of red blood cells into circulation is the trigger for vascular remodelling to occur. Blood flow creates a frictional force known as shear stress against the endothelial cells (ECs) lining the vessels. The shear stress level depends profoundly on the diameter of the vessel (increasing the diameter reduces shear stress), as well as the flow rate and viscosity (increasing the flow rate or viscosity increases shear stress). When shear stress levels are altered in in vivo models, the vasculature remodels, and it is known that shear stress is the driving force for remodelling.ECs are highly influenced by shear stress, and many different signalling pathways become activated. Mechanosensitive structures are found on all surfaces of ECs and include ion channels, the glycocalyx, primary cilia, caveolae, integrins, and the junctional mechanosensory complex of VEGFR2, PECAM and VE-CADHERIN. Stimulation of ECs by flow activates a myriad of different signalling pathways including NOTCH, PIEZO1, WNT/β-catenin, BMP signalling pathways, as well as several arterial and venous markers.Disruptions of BMP signalling have been linked to a genetic predisposition for developing arteriovenous malformations (AVMs) – the direct connection of an artery to a vein bypassing the capillary bed. More specifically, in the disease Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT), mutations in the genes encoding ALK1, Endoglin, BMP9, and SMAD4 have all been linked to AVM formation. All of these components have also been demonstrated to play a role in shear stress-induced signalling. BMP9 binds to the ALK1 receptor and with its co-receptor Endoglin, phosphorylates SMAD1/5/9, which complex with SMAD4 and move into the nucleus to induce downstream signalling. Shear stress amplifies this signal such that even ECs become sensitive to picomolar levels of BMP9. ALK1 is a receptor for ligands in the TGFβ family, and other receptors for these ligands are known to activate non-canonical signalling pathways such as MAPK, JNK, p38, Ras, ERK, NFκB, and mTOR independent of SMAD activation. Whether ALK1 also participates in non-canonical signalling in ECs has not been tested.In vitro and in vivo models of disrupted BMP9/ALK1/ENDOGLIN/SMAD1/4/5/9 mechanotransduction demonstrate that this pathway is critical for regulating EC shape and behaviour. A lack of this signalling results in excessive EC spreading under blood flow, as well as excessive proliferation. Additionally, while ECs normally migrate upstream (against the direction of flow), when mechanosensitive BMP9/ALK1/ENDOGLIN/SMAD1/4/5/9 signalling is disrupted, ECs migrate downstream (with the direction of flow), both in vitro and in vivo. The resulting collection of ECs in the post capillary venules, as well as their inappropriate expansion and proliferation under flow, are hypothesized to contribute to the pathophysiology of AVMs.In this thesis, we first identified Connexin37 (Cx37) as being specifically and differentially regulated by a combination of shear stress and BMP9 signalling. Connexins are transmembrane proteins that function in groups of six to form transmembrane pores (connexons). Connexons from neighbouring cells can link up, forming a gap junction, and facilitate intracellular transport of small molecules. Additionally, the C-termini of connexins can bind to various intracellular proteins and thereby modulate other signalling pathways. We find that BMP9 upregulates Cx37 expression under static conditions but under various shear stress conditions Cx37 is downregulated. Both the upregulation and downregulation of Cx37 were dependent upon SMAD1/5 signalling, which suggests that shear stress also activates non-SMAD1/5 pathways which modulate Cx37 expression. Others, however, have found that shear stress upregulates Cx37 expression when serum is included in the shearing media. We identify BMP10 as the component of serum responsible for changing the pattern of Cx37 expression under flow, implying that BMP10 may more strongly activate Cx37 by non-SMAD1/5 mechanisms.In vivo, we found that mouse embryos with a complete EC-specific ablation of SMAD1/5 spontaneously form AVMs, while compound heterozygosity for SMAD1/5 in ECs results in a susceptibility to TNFα-induced AVM formation. TNFα downregulates Cx37 expression in vitro. During normal vascular development, we found that Cx37 is initially expressed by the entire capillary plexus but becomes downregulated in the enlarging arteries and veins, before taking on a mature, arterial-specific expression pattern. TNFα treatment led to additional Cx37-negative areas of capillaries which correlated to areas of AVM formation. Mechanistically, we show that loss of Cx37 results in downstream migration of ECs with the direction of flow. We therefore propose that Cx37 restrains outward remodelling of vessels in response to flow, and loss of Cx37 is a necessary permissive cue for AVM development in vasculature already prone to improper mechanotransduction (i.e., with disruptions in the SMAD1/5/9 signalling pathway).
|
|---|
